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活性酸素種を細胞ベースで蛍光検出 OxiSelect™ Intracellular ROS 測定アッセイ（緑色蛍光）

メーカー名：Cell Biolabs Inc.

Intracellular ROS アッセイキットは、細胞中のヒドロキシル、ペルオキシルもしくは他の活性酸素種（ROS）を測定する細胞ベースのアッセイです。細胞浸透性蛍光プローブDCFH-DA（2’, 7’-Dichlorodihydrofluorescin diacetate）を利用し、蛍光プレートリーダーで蛍光検出（480 nm/530 nm）します。

特長

1時間以内の迅速プロトコール
高感度（10 pM）
様々なタイプの活性酸素種（ROS）を測定可能

構成内容

DCFH-DA（20×）
DCF スタンダード
Hydrogen Peroxide
細胞溶解バッファー（2×）

測定原理

図1. DCFアッセイのメカニズム

DCFH-DAプローブは細胞内に散在して、細胞内エステラーゼにより脱アセチル化し、非蛍光型 2’, 7’-Dichlorodihydrofluorescin (DCFH) になります。更にROSにより素早く酸化され、強く蛍光する 2’, 7’-Dichlorodihydrofluorescein (DCF)に変化します（図1）。

蛍光強度は細胞質のROSレベルに比例します。DCFH-DA における抗酸化剤もしくはフリーラジカル化合物の影響は、キットに含まれる DCFスタンダードの蛍光に対して測定されます。本キットのDCF 検出限界は、10pMで、96アッセイ分の試薬が含まれています。

使用例

図2．DCF スタンダードカーブ

図3．HeLa 細胞内のROSの測定
96well プレート上で、50,000個のHeLa 細胞を1 mM DCFH-DA で37℃、1時間処理。過酸化水素で20分間処理した。

図3．H₂O₂処理1時間後のHeLa細胞のDCF 蛍光
左: 0 µM; 右: 1000 µM

よくある質問 Q&A

【04】顕微鏡で ROS を検出できますか?

このアッセイは、培養細胞の ROS を検出し、蛍光顕微鏡または蛍光プレートリーダーで読むことができます。細胞をブラックプレートで培養すれば、ライセートを調製する必要はありません。

【10】浮遊細胞に使用できますか?

はい。Intracellular ROS assay kit (品番：STA-342) は、接着細胞と浮遊細胞どちらにも使用することができます。浮遊細胞は、ラベル方法は同じで、1×DCFH-DA で、37℃、30-60分間インキュベートします。そして、DPBS で余分な染色液を除きます。浮遊細胞を洗浄するために、細胞をスピンダウンし、DPBS でペレットを洗浄します。

【14】細胞を固定し、顕微鏡で継時的に蛍光を測定することはできますか?

セルバイオラボ社では固定細胞で試験したことがなく、どのような影響がアッセイに出るか分かりません。また、固定によって酸化のプローブである ROS が誘導されるか、固定された細胞内で ROS が産生されないかについては分かりません。もし倒立顕微鏡をご使用でしたら、反応を止めることなく継時的に顕微鏡下で直接観察することができ、細胞を固定する必要はありません。

下記よりそのほかのFAQもご覧いただけます。

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ROSアッセイキット

OxiSelect™ Intracellular ROS アッセイキット（緑色蛍光）

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
OxiSelect^TM Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	CBL	STA-342	96 ASSAY	￥200,000
OxiSelect^TM Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence), Trial Size	CBL	STA-342-T	20 ASSAY	￥101,000
OxiSelect^TM Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	CBL	STA-342-5	5*96 ASSAY	お問い合わせ