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簡便にビオチン濃度を定量！ Amplite™ 比色ビオチン定量アッセイ

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メーカー名：AAT Bioquest, Inc. (Former ABD Bioquest, Inc.)

Amplite™ 比色ビオチン定量アッセイは、ビオチン-タンパク質コンジュゲート中のタンパク質に対するビオチンのモル比を決定するため、または溶液中のビオチン濃度を定量するための便利な製品です。

背景

ビオチンとは

ビタミンHとも呼ばれるビオチンは、生化学的アッセイにおいて目的のタンパク質を標識するためのビオチン化反応に典型的に利用される水溶性生体分子です。比較的小さな分子なので、ビオチンは、タンパク質の立体配座や生物活性を変えることなく、抗体などの多くのタンパク質に結合させることができます。ストレプトアビジン分子に対する強い親和性（Kd = 10-15 M-1）により非特異的結合が減少し、アッセイ感度を有意に改善します。ビオチンとアビジン／ストレプトアビジンとの間の結合形成は急速に起こり、一旦形成されると、それはpH、有機溶媒および他の変性剤にも影響されません。ビオチン化タンパク質とアビジン／ストレプトアビジンとの強固で特異的な相互作用は、ストレプトアビジンプルダウンアッセイ、ELISAおよびウエスタンブロッティングを含む多数の生物学的用途において広く研究されています。

原理

本アッセイは、アビジンのビオチンへの結合と、アビジンに結合したときに有意なスペクトル変化を示す4'-ヒドロキシアゾベンゼン-2-カルボン酸（HABA）色素の示差的結合に基づいています。サンプルにビオチンを添加すると、HABA /アビジン複合体からHABAが簡単に置き換えられます。この結果、500 nmでの吸収が減少をし、サンプル中のビオチンの濃度と定量的に相関します。本アッセイは、吸光度マイクロプレートリーダーを用いた2～16 µMの範囲のビオチン濃度の決定に最もよく用いられています。

図.1 ビオチン化度を定量化するためのHABAアッセイ原理