タンパク質相互作用解析用 BirAのエピトープタグ抗体 TurboID 抗体

大腸菌由来のビオチンリガーゼ(BirA)変異体の一つであるTurboIDを検出可能なエピトープタグ抗体です。TurboIDは、BioIDと同様にタンパク質相互作用解析を目的とした近接依存性標識法に用いられます。

近接依存性標識（Proximity labelling^1〜3）は、ターゲットタンパク質の近位にビオチン等で標識する技術です。これにより、異なる細胞、組織、発生段階におけるタンパク質相互作用を解析することができます。この技術は、生細胞中のターゲットタンパク質とBioID（BirA）間で実行されます。大腸菌由来のBirAタンパク質変異体（TurboID）はビオチンリガーゼで、活性が大幅に高く、より高い時間分解能を示し、広範なin vivoアプリケーションで応用が可能です。また、標識時間についても、BioIDでは18時間要するのに対し、BirAでは室温で10分のみという利点もあります。

図1：Arabidopsis thaliana の葉由来トータルタンパク質のウエスタンブロット
1- 20 µg A. thaliana- Wt Col-0 (Negative control)
2- 20 µg of A. thaliana expressing POI-TurboID fusion (Independent line 1)
3- 20 µg of A. thaliana expressing POI-TurboID fusion (Independent line 2)
4- 20 µg of A. thaliana expressing POI-TurboID fusion (Independent line 3)
5- 10 ng of purified TurboID (Positive control)
Arabidopsis thalianaの葉から抽出した20 μg/wellのトータルタンパク質をHENS(25mM HEPES pH7.7,1mM EDTA,2.5%SDS)で希釈し、-80℃で保存した。サンプルを95℃で5分間、1xタンパク質ローディングダイ(0.5% Sodium dodecyl Sulfate, 0.002% Bromophenol Blue, 10% glycerol, and 50 mM Tris-HCl pH6.8)で変性させた。サンプルを4〜16%グラジエントSDS‐PAGEゲル上で分離し、セミドライトランスファーを用いてニトロセルロース膜(孔径0.45um)に1時間ブロットした。ブロッキングは、攪拌せずに、5% milk（in TBS-T)中、4℃（オーバーナイト）で行った。ブロットは、攪拌せずに、一次抗体（1:5000希釈）、5% milk（in TBS-T、)、4℃（オーバーナイト）で行った。抗体液をデカントし、ブロットを簡単に洗浄後、撹拌しながらでTBS-T中（室温）で10分間ｘ3回洗浄した。その後、TBS-T中で1:25000に希釈したAgrisera社の二次抗体(HRP標識 anti-rabbit IgG 抗体、品番：AS09602)中で、撹拌しながら1時間インキュベートした。ブロットを洗浄し、Agrisera ECLBrightで2分間発色させた（曝露時間 172秒）。

図2：精製したTurboIDのウエスタンブロット
1- 1 ng of purified TurboID
2- 5 ng of purified TurboID
3- 10 ng of purified TurboID
4- 25 ng of purified TurboID
5- 50 ng of purified TurboID
6- 75 ng of purified TurboID
Mark: PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder; ThermoFisher Scientific; MW of TurboID = 35 kDa
1x Phosphate Buffer Saline(PBS)中の精製TurboIDのウェル1、2、3、4、5、6にそれぞれ1ng、5ng、10ng、25ng、50ng、75ngを添加し、-80℃で保存しした。 サンプルを95℃で5分間、1xタンパク質ローディングダイ(0.5%ドデシル硫酸ナトリウム、0.002%ブロモフェノールブルー、10%グリセロール、および50mM Tris‐HCl pH6.8)中で変性させた。 試料を4〜16% グラジエントSDS‐PAGEゲル上で分離し、セミドライトランスファーを用いてニトロセルロース膜(孔径0.45um)に1時間ブロットした。 ブロッキングは、攪拌せずに、5% milk（in TBS-T)中、4℃（オーバーナイト）で行った。ブロットは、攪拌せずに、一次抗体（1:1000希釈）、5% milk（in TBS-T、)、4℃（オーバーナイト）で行った。抗体液をデカントし、ブロットを簡単に洗浄後、撹拌しながらでTBS-T中（室温）で10分間ｘ3回洗浄した。その後、TBS-T中で1:25000に希釈したAgrisera社の二次抗体(HRP標識 anti-rabbit IgG 抗体、品番：AS09602)中で、撹拌しながら1時間インキュベートした。ブロットを洗浄し、Agrisera ECLBrightで2分間発色させた（曝露時間 92秒）。

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