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メチル化による発現抑制を受けない過剰発現用プラスミド/ウイルス粒子 miRNA発現用レンチウイルスプラスミド&レンチウイルス粒子

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メーカー名：Biosettia Inc.

メチル化による発現抑制を受けないmiRNA過剰発現用プラスミドまたはレンチウイルス粒子を販売しております。

特長

miRNA前駆体がEF1αプロモーター領域にクローニングされているため、イントロン内でのmiRNAプロセスが選択マーカーの発現に与える影響を最小限に抑えます。miRNA前駆体と選択マーカーが同じ転写ユニットに入っていますので、miRNAの転写活性を簡単にモニタリングできます。
レンチウイルス粒子で感染させますので、分裂細胞や非分裂細胞にも効果的に遺伝子導入することができます。レトロウイルスシステムとは異なり、レンチウイルスの遺伝子導入は細胞周期に依存しません。
宿主の染色体に組込まれますので、miRNA は導入細胞株で安定して発現します。
ヒトEF1αプロモーターは、細胞内で発現が抑制されることはありません。CMVやSV40等のウイルスプロモーター活性は、しばらくするとDNAのメチル化により発現が抑制されることが報告されています。miRNA前駆体やピューロマイシン選択マーカーの発現に使われるヒトEF1αプロモーターは、ハウスキーピング遺伝子のプロモーターであるため、in vitroやin vivoでメチル化により発現が抑制されることはありません。
EF1αプロモーターから発現したrPuro遺伝子産物は、赤色蛍光 puromycin-N-acetyl-トランスフェラーゼです。miRNA発現カセットを導入した細胞は、ピューロマイシンの存在下で選択されるだけでなく、587/610nm（励起／発光）の波長で赤色蛍光を示します（図2）。

図2 hsa-mir-24-1発現カセットを持つレンチウイルスを形質導入した293T細胞の顕微鏡画像

構成内容

■miRNA発現用レンチウイルスプラスミド　(デザイン済、品番 MIR-PXXX)
：各pLV-miRNAプラスミドDNAは、バクテリアのグリセロールストック(1m)としてご提供いたします。

■miRNA発現用レンチウイルス粒子　(デザイン済、品番 MIR-LVXXX）
：各miRNA発現用レンチウイルス粒子は、1×10⁷IU/mLとしてご提供いたします。

miRNAレンチウイルス発現ベクターの比較

miRNA発現	バイオセティア社	A社	B社	C社
フォーマット	レンチウイルスプラスミド／レンチウイルス粒子（pLV-miRNA）	合成RNA	レンチウイルスプラスミド	レンチウイルスプラスミド
恒常的発現	○	×	○	○
隣接配列	～100bp	-	～200bp	～250bp
発現方法	EF1α-［miRNA］-rPuro （1プロモーター）	-	CMV-RFP-miRNA-IRES-Puro （1プロモーター）	CMV-RFP-miRNA-EF1α-GFP （2プロモーター）
miRNAの発現	イントロン内	-	エクソン内	エクソン内
選択マーカー	RFP, Puromycin	×	RFP/Puromycin	GFP
転写／発現	イントロン内のmiRNAのプロセッシングはRFP-Puro発現への影響を最低限に抑える	-	miRNAのプロセッシングがmRNAの分解を引き起こす可能性有	miRNAとGFPは2種類のプロモーターにより発現
細胞への導入方法	トランスフェクション／ウイルス感染	トランスフェクションによる	ウイルス感染（要パッケージング）	ウイルス感染（要パッケージング）

ウイルスプラスミドまたはウイルス粒子を提供

miRNAレンチウイルスプラスミド　(デザイン済)

ヒトmiRNA（hsa-mir）前駆体と隣接するゲノム配列(約100bp)をPCRにより増幅し、pLV-miRNAベクター（図1）にクローニングしています。
miRNAが適切に発現して作用しますので、内因性のmiRNAと同様の機能が期待できます。

図1 miRNA発現カセットを有するレンチウイルスプラスミド

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miRNAレンチウイルス粒子

Ready-to-useのｍｉＲＮＡレンチウイルス粒子

miRNAレンチウイルス粒子は、pLV-miRNAコンストラクトとレンチウイルスパッケージングプラスミド、レンチウイルスエンベローププラスミドをHEK293T細胞に導入して作製しています。レンチウイルスの力価は、HT1080細胞に対し、通常1×10⁷ IU/mL以上です。

EF1αイントロン中にクローニングされたmiRNA発現レンチウイルス
図3 EF1αプロモーターのイントロンにmiRNA発現カセットを有するレンチウイルス

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miRNA発現用レンチウイルスプラスミド　(デザイン済)

各pLV-miRNAプラスミドDNAは、バクテリアのグリセロールストック(1m)としてご提供いたします。

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miRNA発現用レンチウイルス粒子 (デザイン済)

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