バックグラウンドを最小限に抑える消光剤 TrueBlack® リポフスチン自家蛍光クエンチャー（20X in DMF）

TrueBlack®は、免疫蛍光染色後に、組織切片で観察されるリポフスチン（lipofuscin）の自家蛍光を消光するための試薬です。

リポフスチン（lipofuscin）は、酸化したタンパク質や脂質を含む自家蛍光を発する顆粒から成り、老化した細胞のリソソームに蓄積します（1）。リポフスチン顆粒は、蛍光顕微鏡法で使用する全てのチャネルにおいて明るい蛍光を発し、加齢に伴って多様な細胞や組織に蓄積します。

そのため、リポフスチンの自家蛍光を消光もしくはマスクする方法がなければ、ヒト成人組織または老齢動物組織において特異的な免疫蛍光染色のシグナルを画像化することは、実質的に不可能です。従来は、免疫蛍光染色を行った後に、組織切片をスーダンブラックBとインキュベートすることでリポフスチンの自家蛍光を消光していました（2）。しかし、スーダンブラックBは、リポフスチンの自家蛍光をマスクする一方で、赤色や近赤外領域において非特異的なバックグラウンドの原因となるため（3）（図1）、使用できる蛍光色素が制限されます。

Biotium 社では、スーダンブラックBに替わるクエンチャーとして、リポフスチンの自家蛍光を低減し、バックグラウンドを最小限にする TrueBlack® を開発しました（図1）。免疫染色した組織の TrueBlack® 処理は、迅速かつ簡単に行うことができ、蛍光抗体や対比染色した核のシグナルに対する影響が最小限であることから、免疫染色のS/N比を維持します（図2）。TrueBlack® は、コラーゲン、エラスチン、赤血球などの他の発生源からの自家蛍光も低減します。これらの自家蛍光の低減はリポフスチンほど効果的ではありませんが、ヒトおよび非ヒト組織のバックグラウンドを改善できます (図3〜4)。

• リポフスチン自家蛍光を低減
• スーダンブラックBのような高いバックグラウンドなし
• 明瞭なヒト・高齢動物組織の蛍光画像

図1　メタノール固定したヒト成人組織におけるリポフスチンの自家蛍光
未処理の組織（上段）では、リポフスチンは、全ての蛍光チャネルで蛍光を発する顆粒として観察される。スーダンブラックB（中段）は、リポフスチンの自家蛍光をマスクするものの、赤色や近赤外領域でバックグラウンドが観察される。TrueBlack® （下段）は、バックグラウンドをほとんど増加させずにリポフスチンをマスクする。メタノール固定したヒト成人大脳皮質の凍結切片は、未処理、もしくは製品プロトコールに従い 0.1% スーダンブラックB（70% エタノール）/ 1X TrueBlack® を用いて染色した。Zeiss 社 LSM 700 共焦点顕微鏡を用いて、同じゲイン設定で FITC (緑)、Cy3 (赤)、Cy5 (近赤外) チャネルを画像化した。

Cy はGE Healthcare 社の登録商標です。

図2　TrueBlack® 処理／未処理の免疫蛍光染色画像
ヒト大脳皮質の凍結切片をメタノール固定し、ウサギ抗GFAP抗体（一次抗体）、CF™ 640R ヤギ抗ウサギ抗体（二次抗体、品番： 20176）、DAPI（品番： 40009）で染色した。切片は未処理、または TrueBlack® 処理し、EverBrite™ Mounting Medium（品番： 23001）で封入した。未処理の切片（左）は、GFAP 免疫染色（グリア突起、マゼンタ）、DAPI染色（核、青）の他に、リポフスチンの自家蛍光（白矢印）を示した。TrueBlack® 処理した切片（右）では、リポフスチンの蛍光が低減し、近赤外チャネル（マゼンタ）や対比染色した核（青）で良好なS/N比を維持した。

図3　TrueBlack® 処理による、リポフスチン以外の自家蛍光の低減（ヒト組織）
未処理のヒト腎臓切片で、細胞外マトリックスや血球などの複数の発生源からの自家蛍光を示したが (上) 、TrueBlack®処理したヒト腎臓切片で自家蛍光が減少した (下)。

図4　TrueBlack® 処理による、リポフスチン以外の自家蛍光の低減（非ヒト組織）
ラットの腎臓切片を未処理のままにするか、TrueBlack®で処理した後、DAPI (核、青色) で染色した。未処理の組織は細胞外マトリックスから緑色の自家蛍光を示したが (左) 、TrueBlack®処理をした組織で自家蛍光が減少した (右) 。

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