記事ID ： 36226

細胞増殖アッセイの画像化解析に Bucculite™ dU 取込　細胞増殖イメージングキット（蛍光）

メーカー名：AAT Bioquest, Inc. (Former ABD Bioquest, Inc.)

本キットは、チミジンアナログであるFOL-dUを使用し、DNA合成中に細胞DNAに組み込まれたFOL-dUをモニターすることにより細胞増殖の分析を行います。

背景

細胞増殖のモニタリングは、細胞の生存率、細胞周期、遺伝毒性を評価する最も信頼できる方法の1つです。細胞増殖を検出するための重要な方法は、細胞増殖のS期中にチミジンの存在下でDNA合成を測定することです。これまで、細胞増殖のモニターには3H-チミジンといったチミジン類似体の取り込みが利用されてきました。増殖性細胞は、この放射性標識を複製細胞の新たに合成したDNAに組込みます。細胞より回収したDNAの放射活性を測定するためには、シンチレーションカウンターが必要です。放射性標識を利用するため、時間を要するだけでなく危険であり、放射性物質を適切に廃棄する必要があります。近年では、危険で面倒な放射性標識を用いない、同様のアプローチとして5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU) を利用する方法があります。BrdUは新たに合成されるDNAに組込まれ、標識済み抗-BrdU抗体を用いて増殖生細胞を間接的に検出します。標識として酵素やフルオロフォアを使用することができ、使用した標識に応じて比色定量、蛍光定量、または化学発光検出を行います。

特長

3H-チミジンおよびBrdU代替品として優れています。
抗-BrdU抗体を利用しないため、増殖生細胞を直接検出できます。
簡便なうえ、放射性標識や銅触媒したEdUといった毒性物質を使用しません。
蛍光標識抗体とのマルチプレックスアプリケーションにも適しています。
さまざまな波長に対応したキットを取り揃えております。

構成内容

Component A: FOL-dU , 1 vial
Component B: iFluor™ (488 or 555 or 647)-MTA , 1 vial
Component C: Staining Buffer, 20mL or 50mL
Component D: 10X Washing Buffer , 10mL
Component E: DMSO, 1mL
Component F: Hoechst 33342 , 50uL (10 mg/mL in water)

原理

本キットは、蛍光標識したチミジンヌクレオシド類似体であるFOL-dUを利用し、これが細胞周期の複製期（S期）に新たに合成されるDNAへと組込まれます。細胞を固定化後、組込まれたFOL-dUをMTA-iFluor™で染色し、蛍光顕微鏡のFITC、TRITC、またはCy5チャネルで画像化します。

プロトコール概要

細胞を調製 (100 μL/well for a 96-well plate or 25 μL/well for a 384-well plate)
2X FOL-dU ワーキング試薬を添加 (100 μL/well for a 96-well plate)
37℃で3時間インキュベート
培地を除去し、室温にて細胞を100μL ice cold 90% Methanol in PBSで15分固定
固定バッファーを除去し、PBSで3回洗浄
1X iFluor™ MTA ワーキング試薬 (100 μL/well) を添加し、室温で30分間染色
ワーキング試薬を除去し、1X洗浄バッファーで細胞を3回洗浄
1X洗浄バッファーを100μL/well添加し、FITCまたはTRICまたはCy5フィルターセットを備えた蛍光顕微鏡で観察

商品データ

図1. Bucculite™ dUの励起と発光スペクトル
1) Bucculite™ dU with green fluorescence (品番：22305)
2) Bucculite™ dU with red fluorescence (品番：22315)
3) Bucculite™ dU with deep red fluorescence (品番：22320)

図2. Bucculite™ dU Incorporation Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit (品番：22305) を用いてS期のHeLa細胞を検出した。HeLa細胞を50,000 cells/well/100 μL で96穴の黒色/クリアボトムプレートに播種して一晩培養した。細胞をFOL-dUにより37℃で3時間処理した後、メタノールで固定した。固定化後、細胞を染色緩衝液中に入れ iFluor488-MTAで30分間染色した後、PBSで洗浄した。各ウェルに100μLのシグナル促進剤を添加後、S期細胞はFITCフィルターで蛍光画像を取得 (緑色) した。また全細胞をヘキスト33342で30分間処理し、DAPIフィルターで核の画像を取得 (青色) した。

Bucculite™ dU 取込　細胞増殖イメージングキット（蛍光）

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
Bucculite^TM FdU Cu-Free Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit Deep Red Fluorescence	ABD	22320	1 KIT [200 Tests]	￥120,000
Bucculite^TM FdU Cu-Free Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit Green Fluorescence	ABD	22305	1 KIT [200 Tests]	￥120,000
Bucculite^TM FdU Cu-Free Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit Red Fluorescence	ABD	22315	1 KIT [200 Tests]	￥120,000