HDL画分で定量 HDLコレステロール測定アッセイキット

HDLコレステロールアッセイキットは、血清、血漿中 HDL画分のコレステロールを測定します。トータルコレステロールアッセイキット と同様に簡易なプレートベースフォーマットです。

血中HDL と LDLコレステロールの値は、多くの疾患状態で重要な指標になります。LDL の高い血中濃度は、健康上の問題と心血管疾患に関係します。そのため、LDLコレステロールは、時に「悪玉コレステロール」と呼ばれます。動脈内に蓄積するLDL粒子は、時間をかけてプラーク（粥腫）を形成し、脳卒中、心臓発作、または血管疾患の可能性を高めます。

一方、HDL粒子は、動脈内からコレステロールを除去することができ、コレステロールを再利用や排泄のために肝臓に輸送します。そのため、HDL 粒子内で運ばれるコレステロールはしばしば「善玉コレステロール」と呼ばれます。異なるリポタンパク質の循環レベルをモニターすることは、アテローム性動脈硬化症などの脂質の輸送障害の診断において非常に重要です

図1．リポタンパク質の構造

• 感度：検出限界　1μM
• 迅速：45分間のアッセイプロトコール
• 簡便：96ウェル蛍光プレートリーダー検出

• 96ウェルマイクロプレート
• コレステロールスタンダード
• 希釈液
• 蛍光プローブ
• HRP
• 沈降溶液(2X)
• コレステロールエステラーゼ
• コレステロールオキシダーゼ

図2．HDLコレステロール測定キットの原理

HDLコレステロールアッセイキットは、血清、血漿中のHDLコレステロールを測定します。キットには、他のリポタンパク質（LDL、VLDL、IDL、カイロミクロン）からHDLを分離するための試薬が含まれています。

HDL画分を分離後のコレステロールアッセイは、コレステロールエステルと遊離コレステロール両方を定量化する酵素法に基づきます。コレステロールエステルは、コレステロールエステラーゼを介して、コレステロールに加水分解されます。続いて、コレステロールオキシダーゼによって酸化され、cholest-4-en-3-one と過酸化水素を生じます。HRP（Horseradish peroxidase）が、プローブと過酸化水素の 1：1の比率での反応を触媒します。サンプルは、96ウェルプレートフォーマットで、既知濃度のコレステロールスタンダードと比較されます。サンプルとスタンダードは、45分間インキュベートされ、標準的な蛍光プレートリーダーで測定します（図1）。

1．HDL画分の調製

1. 血清または血漿サンプル200 μLをマイクロ遠心チューブに加えます。2X沈殿試薬を200 µL加え、ボルテックスで混合後、混合物を室温で5〜10分間インキュベートします（沈殿が生じます）。
2. 2000 x g (〜5000 rpm) で20分間遠心。上清（HDL画分）をゆっくり慎重に新しいチューブに移してください。ペレットは捨てます（他のリポタンパク質LDL、VLDL、Chylomicronなどを含む画分）。
3. HDL画分を1X希釈液で 1:25 (1:50 final dilution)〜1:100 (1:200 final dilution)に希釈します。

2．コレステロールアッセイ

1. 50 µLの希釈済みスタンダードまたはHDL画分サンプルを96ウェルマイクロプレートに加えます。
2. 各ウェルに、50 µLの調製済みコレステロール反応試薬を添加します。
3. 遮光のためにプレートをカバーし、37℃で45分間静置します。
4. 蛍光プレートリーダーで測定します。
   （excitation in the 530-570 nm range and for emission in the 590-600 nm range.）
5. コレステロールスタンダードカーブと、サンプルのRFUを比較することにより、試料中のコレステロールの濃度を計算します。

図3．コレステロールのスタンダードカーブ

図4．ヒト血清中のHDLコレステロール量

左：沈殿後、LDL/VLDL を除去。血清および血漿サンプルは、サンプル調製プロトコルに従って沈殿溶液で処理した。LDL/VLDLの除去は、Human ApoB ELISA (STA-368)で確認した。 
右：ヒト血清中のHDLコレステロールを沈殿前後で測定

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