遺伝子発現制御、転写因子の解析に クロマチンのDNA断片化酵素CUTANA™ pAG-MNase

EpiCypher社CUTANA™ pAG-MNaseは、大腸菌で発現させたProteinA、ProteinGとミクロコッカスヌクレアーゼの融合タンパク質です。Chromatin Immunocleavage (ChIC)⁽¹⁾やCleavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&RUN)^{(2, 3)}に使用できます。

Cleavage Under Target & Release Using Nuclease (CUT&RUN)はSteven Henikoff氏らのグループによって開発されたゲノムマッピング法です⁽³⁾。CUT&RUNはChromatin ImmunoCleavage（ChIC）に基づいて構築され、プロテインAとMicrococcal Nuclease（pA-MNase）の融合体により、in situで抗体結合クロマチンを選択してDNA切断します。CUT&RUNでは、細胞や核は固体支持体に固定され、pA-MNaseは溶液から分離されたDNA断片を切断します。CUT&RUNのワークフローは、次世代シークエンス解析（NGS）に適しており、ヒストンの翻訳後修飾（Post-Translational Modification, PTM）やクロマチン関連タンパク質のゲノムワイドなプロファイルを生成します。

図1：CUTANA™　EpiCypher CUT&RUNプロトコール概要

CUT&RUN Protocol

• 抗体結合クロマチンのDNAを選択的に切断
  Micrococcal NucleaseにプロテインA、プロテインGが融合しているので抗体に結合します。

図2：CUTANA™ pAG-MNase 1μgをSDS-PAGEで泳動し、クマシーブルーで染色した。

図3：Size Distribution of Released
K-562細胞 0.5x 10⁶にCUTANA™ pAG-MNaseを使用し、クロマチンCUT&RUNを行った。NEBNextUltra II DNA prep Kitを用いて、精製DNAからシークエンス解析用のライブラリを構築した。Agilent社BioanalyzerでHistone H3K4me3由来のライブラリ（blue track; ThermoFisher Scientific社品番PA5-27029, Lot SG2419844A、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4)抗体）と、Histone H3K27me3由来のライブラリ （orange track; Cell Signaling Technology 社品番9733, Lot 14、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27)抗体）を解析した。切除されたDNAはモノヌクレオソームが豊富である（300bpのピークは150bpのインサートサイズを反映している）。

図4：CUT&RUN Data
CUTANA™ pAG-MNaseを用いて得られたシークエンストラック。（A）CUT&RUNはK-562細胞0.5 x10⁶個にHistone H3K4me3抗体（ThermoFisher Scientific社品番PA5-27029, Lot SG2419844A）を用いて行った。比較のために、2.0x 10⁷細胞を用いているENCODEからリファレンスChIP-seqトラック（GEO Accession GSM2534288, Run SRR5339104 at locus chr1:26,732,009-26,900,000）を用いた。（B）CUT&RUNはK-562細胞0.5 x10⁶個にHistone H3K27me3抗体（Cell Signaling Technology 社品番9733, Lot 14）を用いて行った。比較のために、ENCODEからリファレンスChIP-seqトラック（GEO Accession GSM733658, combined Runs SRR227389 + SRR227390 at locus chr20:35,914,690-36,600,000）を用いた。
A、B、いずれの場合でもCUTANA™ pAG-MNaseは10倍以上のシークエンス深度と40分の1の細胞数で、優れた感度とS/N比を示した。

ChIP-seq vs CUT&RUN

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