記事ID ： 42908

低バックグランドでエクソソームの膜染色 ExoBrite™ EV Membrane Staining Kits

メーカー名：Biotium, Inc.

ExoBrite™ EV Membrane染色キットは、エクソソーム検出の課題を克服するために開発されました。ExoBrite™染色は、エクソソーム膜の分子に結合し、フローサイトメトリーによって分離されたEVを特異的に染色します。ExoBrite™染色の主な利点は、他の多くの色素とは異なり、エクソソームやEVと同様のサイズのバックグラウンドをほぼ染色しない点です。また、他の膜色素とは異なり、ExoBrite™染色液はポリスチレンビーズに非特異的に結合しないため、ビーズに結合したエクソソームの染色に使用できます。

図1.MCF-7細胞に由来するビーズ結合エクソソームのフローサイトメトリー

背景

エクソソーム解析では、エクソソームのサイズが小さく取り扱いと分析が困難でした。フローサイトメトリーでは、エクソソームは細胞破片やその他の小さな粒子と区別するのが難しい場合があり、そのサイズは一部のフローサイトメーターの検出限界以下となります。特定の色素または抗体で染色するとエクソソームを他の粒子と区別するのに役立ちますが、これらの小さな粒子自体が染色されたエクソソームと混同される可能性があるため、バックグランドを蛍光しない染色色素を使用することが重要です。

分析前にEVを濃縮または精製するために使用される方法も重要な要素です。単純なPEG沈殿ステップで濃縮されたサンプルには、多くの場合、膜染色色素にも結合する可能性のある非EV脂質粒子が大量に含まれています。これらの不純物は、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）や免疫沈降などの他のEV精製法を使用して減らすことができます。抗テトラスパニン抗体に結合した磁気ビーズを使用することで、純粋なエクソソームを得ることができます。ただし、これらのビーズは、膜染色色素などの多くの疎水性色素と非特異的に結合する可能性があります。

使用目的

他の一部の染色色素は、エクソソームまたはEVと同様のサイズの凝集体を形成する可能性があるため、バックグラウンドが蛍光し分析が混乱しますが、ExoBrite™染色ではバックグラウンドがほとんど染色されないため、染色されたエクソソームを正確に識別できます。ExoBrite™染色は、エクソソーム膜の分子に結合して、鮮やかで特異的な染色を実現します。
エクソソームは、多くの場合、テトラスパニンタンパク質CD9、CD63、およびCD81の1つまたは複数を標的とする蛍光抗体を使用して検出されます。ExoBrite™EV Membrane染色キットは、マルチパラメーター分析のために、抗体染色と組み合わせることができます。Biotium社では、エクソソーム染色が検証されたCD9およびCD81モノクローナル抗体を販売しており、精製ずみ、もしくは可溶性のCF®色素に結合されています。

特長

EVとエクソソームの膜を染色
精製されたエクソソームとビーズに結合したエクソソームの両方を染色
鮮やかなシグナルと低いバックグラウンド
フローサイトメトリーによる検出用に設計
抗体との共染色が可能
1バイアルで500回分の染色が可能

構成内容

ExoBrite™ EV Membrane Stain
ExoBrite™ Reconstitution Solution

ExoBrite™EV Membrane染色キットで染色された精製エクソソーム

図2. SECで精製したMCF-7由来のエクソソームをExoBrite™490 / 515 EV Membrane染色キットで染色しました（右）。バッファー中の同じ染色と比較して、特異的な染色が見られました（左）。エクソソームは、FITCチャネルのCytoFLEXLXフローサイトメーターで検出されました。

図3. SECで精製したMCF-7由来のエクソソームをExoBrite™560 / 585 EV Membrane染色キットで染色しました（右）。バッファー中の同じ染色と比較して、特異的な染色が見られました（左）。エクソソームは、PEチャネルのCytoFLEXLXフローサイトメーターで検出されました。

ExoBrite™EVMembrane染色キットで染色されたビーズ結合EV

図4. MCF-7細胞に由来するビーズ結合エクソソームのフローサイトメトリー。未染色のエクソソーム（灰色）または10XExoBrite™490/515（緑色）で染色。エクソソームは、FITCチャネルのCytoFLEXLXフローサイトメーターで検出した。

図5. MCF-7細胞に由来するビーズ結合エクソソームのフローサイトメトリー。未染色のエクソソーム（灰色）または10XExoBrite™560/585（オレンジ）で染色。エクソソームは、R-PEチャネルのCytoFLEXLXフローサイトメーターで検出した。

ExoBrite™EV Membrane染色/抗体共染色

図6. SECで精製したMCF-7由来のエクソソームを、1mLの10XExoBrite™560/585EV Membrane染色および0.1ug/mLのCD9（H19a)-CF®488Aで同時に染色。ExoBrite™560/585陽性粒子で染色した場合、約95％がCD9に対しても陽性だった（上段）。同様に、CD9陽性粒子で染色した場合、約95％がExoBrite™560/585に対しても陽性だった（下段）。

ExoBrite™ EV Membrane Staining Kits

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
ExoBrite^TM 410/450 CTB EV Staining Kit	BTI	30111-T	1 KIT [100 labelings]	￥47,000
ExoBrite^TM 410/450 CTB EV Staining Kit	BTI	30111	1 KIT [500 labelings]	￥162,000
ExoBrite^TM 490/515 CTB EV Staining Kit	BTI	30112-T	1 KIT [100 labelings]	￥47,000
ExoBrite^TM 490/515 CTB EV Staining Kit	BTI	30112	1 KIT [500 labelings]	￥162,000
ExoBrite^TM 560/585 CTB EV Staining Kit	BTI	30113-T	1 KIT [100 labelings]	￥47,000
ExoBrite^TM 560/585 CTB EV Staining Kit	BTI	30113	1 KIT [500 labelings]	￥162,000
ExoBrite^TM 640/660 CTB EV Staining Kit	BTI	30114-T	1 KIT [100 labelings]	￥47,000
ExoBrite^TM 640/660 CTB EV Staining Kit	BTI	30114	1 KIT [500 labelings]	￥162,000

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Biotium社では、CF® Dyes ビオチンなど幅広い色素で標識したエクソソームマーカーを取り揃えています。これらの抗体はCD63-specific magnetic beads (Thermo Fisher Scientific)が結合したMCF-7由来の細胞外小胞（濃縮済み）を用いたフローサイトメトリーにより、エクソソーム検出の特異性を検証済です。詳細は下記をご覧ください。