生細胞内の一酸化窒素をフローサイトメトリーもしくはマイクロプレートリーダーで検出 Cell Meter™ 細胞内NO活性蛍光測定キット

本商品は、生細胞中の一酸化窒素（NO）を蛍光で検出するキットです。

一酸化窒素（NO）は、多くの生理学的・病理学的プロセスに関与する重要な生物学的レギュレーターです。NO産生に変化が生じると、免疫系や血管系、神経変性、炎症性など様々な疾患に影響を及ぼします。NOはフリーラジカルのため、生体内では迅速に酸化され、比較的低濃度で存在します。そのため、生物学的システムにおけるNOの役割を検出および理解することは容易ではありません。

本商品では、生細胞の細胞内NOレベルを高感度にモニターできます。Nitrixyte™ プローブは DAF-2 の優れた代替として、細胞内のフリーNOの検出に使用されます。Nitrixyte™ はDAF-2と比較して光安定性が高く、細胞透過性が強化されています。
AAT Bioquest社では、Cy3® や TRITC と類似のスペクトル特性を有する Nitrixyte™ Orange（Ex/Em 488/590 nm）、Texas Red® と類似のスペクトル特性を有する Nitrixyte™ Red（Ex/Em 630/660 nm）、近赤外蛍光スペクトルの Nitrixyte™ NIR（Ex/Em 650/680 nm）を使用したキットをご用意しています。

DAF-2 (他社製品) との比較データ

図1.　外因性一酸化窒素（NO）の蛍光イメージング
HeLa細胞で NONOate（NOドナー）処理における外因性 NO の蛍光イメージングを行った。細胞は AAT Bioquest (ABD) 社のNitrixyte™ Orange (左) もしくは DAF-2 diacetate (右)を同濃度で 30分間インキュベートした後、1 mM DEA NONOateで37℃ 30分間処理した。蛍光シグナルは蛍光顕微鏡のTRITC（左）とFITC（右）のフィルターでそれぞれ検出した。

図2.　外因性一酸化窒素（NO）のマイクロプレートリーダーによる測定
HeLa細胞における NONOate（NOドナー）処理における外因性NO をマイクロプレートリーダーで測定した。細胞はABD社のNitrixyte™ Orange (左) もしくはDAF-2 diacetate (右)を同濃度で30分間インキュベートした後、37℃ 30分間 1mM DEA NONOate 処理した。蛍光シグナルは Ex/Em = 540/590 nmもしくは Ex/Em = 490/530 nm でそれぞれ測定した。 （A）で示したNONOate処理サンプルのRFUを対応する非処理コントロールのRFUで割った値を（B）シグナル-ノイズ比として示した。 DAF-2 diacetateに比べ、Nitrixyte™ Orangeは優位に高いシグナル-ノイズ比を示した。

図3. 内因性一酸化窒素（NO）の蛍光イメージング
RAW 264.7 マクロファージにおける内因性NO の蛍光イメージングを行った。細胞はABD社の Nitrixyte™ Orange (左) もしくは DAF-2 diacetate (右)を同濃度で 30分間インキュベートした後、20 µg/mL リポポリサッカライド（LPS)と1 mM L-アルギニン（L-Arg）で 37℃ 16時間処理した。蛍光シグナルは蛍光顕微鏡の TRITC（左）とFITC（右）のフィルターでそれぞれ検出した。

フローサイトメトリー用

• Component A: 500×Nitrixyte™ Orange（品番：16351）またはRed（品番：16356）、NIR (品番：16360）
• Component B: NONOate ポジティブコントロール
• Component C: アッセイバッファー

マイクロプレートリーダー用

• Component A: 500×Nitrixyte™ Orange （品番：16350）またはNIR（品番：16359）
• Component B: アッセイバッファーI
• Component C: アッセイバッファーII

フローサイトメトリー用

1. 保温した培地（もしくは適切なバッファー）0.5 mLに細胞数5×10⁵-1×10⁶ 個/mLの細胞を懸濁します。
2. 1 µLの500×Nitrixyte™ プローブ試薬（Component A）を0.5 mLの細胞懸濁液に加えます。
3. 2.の細胞懸濁液に試験する化合物を加え、NOが産生されるのに必要な時間、37℃でインキュベートします。
4. ポジティブコントロールとしてNONOate処理用に、Component BのバイアルにddH₂Oを加え、50 mMのストック溶液を調製します。使用する際はアッセイバッファー（Component C）で1-2 mMに希釈します。
   Nitrixyte™ プローブ試薬で30分間プレインキュベートした細胞をスピンダウンします。1 mM DEA NONOate ポジティブコントロールワーキング溶液に再懸濁し、37℃でさらに30分間（品番：16360 は60分間）インキュベートします（図1参照）。
5. フローサイトメトリーで蛍光強度を測定します。

マイクロプレートリーダー用

フローサイトメトリー用
Orange（品番：16351）、Red（品番：16356）、NIR（品番：16360）

図4. Jurkat細胞を用いたNOの検出
一酸化窒素供与体であるDEA NONOateで処理したもの（赤色）とDEA NONOateで未処理のもの（青色）のシグナルをフローサイトメーターで検出した。
（上段左）品番：16351　（上段右）品番：16356　（下段左）品番：16360

マイクロプレートリーダー用
Orange（品番：16350）、NIR（品番：16359）

図5. DEA/NONOate処理（NOドナー）したCHO-K1細胞、HeLa細胞のNO検出（品番：16350）
各細胞をNitrixyte™ Orangeワーキング溶液で37℃、30分間インキュベートした後、染色を停止するためワーキング溶液を除去した。さらに 10 mM HEPES（pH=6.2）を持つHBSSに 1 mM DEA/NONOate を含むもの、含まないもので処理し、37℃、30分間インキュベートした。各ウェルの溶液を除去後アッセイバッファーII を添加し、蛍光シグナルを測定 （FlexStation (Molevular Device)、Ex/Em = 540/590 nm (cut off = 570 nm)、bottom read mode）。

図6. RAW 264.7 マクロファージ細胞のNO検出
培地に Nitrixyte™ プローブ試薬を加え、かつ20 µg/mLのLPSと1 mMのL-アルギニン（L-Arg）を含む培地と含まない培地に分け、37℃で16時間インキュベートした。各ウェル内の溶液を取り除き、アッセイバッファーII（Component C）を加え、蛍光シグナルを測定。
（上段）Nitrixyte™ Orange （品番：16350）、（下段）Nitrixyte™ NIR（品番：16359）

図7. 細胞内一酸化窒素 (NO) とトータルROS の同時蛍光イメージング
RAW264.7マクロファージの細胞内NOとトータルROSの蛍光イメージングを同時に行った。 AAT社のNitrixyteTM Orange （品番：16350）とAmpliteTM ROS Green (品番：22900)で共染色した後、 20ug/mL リポポリサッカライド（LPS)、1 mM L-アルギニン（L-Arg）、50 uM Pyocyanin (Pyo)で 37℃ 16時間処理した。蛍光シグナルは蛍光顕微鏡のTRITC（赤　NitrixyteTM Orange ）とFITC（緑 AmpliteTM ROS Green ）のフィルターでそれぞれ検出した

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