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記事ID : 17167
研究用

MPO阻害剤などのハイスループットスクリーニングにも使用可能Amplite™ ミエロペルオキシダーゼ蛍光測定キット

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本商品は、溶液中や細胞ライセート中のミエロペルオキシダーゼ(Myeloperoxidase、MPO)を蛍光または吸光度で検出するキットです。

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背景

ミエロペルオキシダーゼ(MPO)は好中球や単球中にもっとも豊富に存在し、ペルオキシダーゼ活性を有する緑色の血液タンパク質です。MPOは過酸化水素とハロゲンイオンとの反応を触媒し、細胞傷害性の酸およびその中間体を形成します。それにより腫瘍細胞や微生物の酸素依存性殺菌における重要な役割を担います。MPO欠損症は酵素の遺伝的欠損であり、免疫不全に罹る要因になります。

使用目的

本商品は、溶液中や細胞ライセート中のMPOを迅速かつ高感度に測定します。96ウェルや384ウェルプレートのフォーマットで使用でき、また分離ステップを介せずオートメーションアッセイでのハイスループットスクリーニングにも適応可能です。キットにはAmplite™ Red 基質が使用されており、シグナルは蛍光(Ex/Em = 540/590 nm)または吸光度(576 nm)の両方で測定が可能です(dual recordable mode)。
蛍光検出の場合の感度は、0.1 mU/mL (ミエロペルオキシダーゼ/100 µL 反応液)です。

構成内容

  • Component A: Amplite™ Red (光感受性)
  • Component B: アッセイバッファー
  • Component C: H2O2
  • Component D: MPO(ミエロペルオキシダーゼ)スタンダード
  • Component E: DMSO

プロトコール

ストック溶液の調製
  1. Red ストック溶液 (250×):40 µLのDMSO(Component E)をAmplite™ Red基質(Component A)のバイアルに加えます。
  2. 10 mM H2O2ストック溶液(500×):10 µLの3% H2O2(0.88M、Component C)を870 µLのアッセイバッファー(Component B)に加えます。
  3. 200 mU/mL MPOストック溶液:50 µLのアッセイバッファーをMPOスタンダード(Component D)に加えます。
アッセイミクスチャーの調製

下記の表1に従い、遮光下でアッセイミクスチャーを調製します。

MPOスタンダードの調製(0-10 mU/mL)
  1. 20 µLのMPOストック溶液を380 µLのアッセイバッファーに加え、10 mU/mL MPOスタンダード溶液を調製します。
  2. 10 mU/mL MPOスタンダード溶液を150 µL取り、1:3で連続希釈します(3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0 mU/mL)。
  3. 50 µLのサンプル溶液(またはスタンダード溶液)を黒色96ウェルプレートに加えます。
    ブランクのウェルには50 µLのアッセイバッファーを加えます。
MPOアッセイ
  1. 50 µLのアッセイミクスチャーを各ウェルに加えます。各ウェルのトータル液量は100 µLになります。
  2. 遮光し、室温で15-30分間インキュベートします。
  3. 蛍光強度をプレートリーダーでモニターします(Ex/Em = 530-570/590-600 nm)。
データ解析
ブランクのウェルの測定値をコントロールとし、サンプルやスタンダードの測定値から減算します。

 

表1. アッセイミクスチャーの構成(96ウェル分)
構成品 容量
Amplite™ Red ストック溶液 (250×) 20 µL
H2O2 (500×) 10 µL
アッセイバッファー (Component B) 5 mL
合計 5.03 mL

製品データ

MPO投与反応の測定

図1. MPO投与反応の測定
Gemini 蛍光マイクロプレートリーダー (Molecular Devices)で測定した結果、0.1 mU/mLの低濃度のMPOも検出できた。

参考文献

参考文献はコチラ

Amplite™ ミエロペルオキシダーゼ蛍光アッセイキット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
AmpliteTM Fluorimetric Myeloperoxidase Assay Kit *Red Fluorescence*詳細データ ABD 11301 1 KIT
[200 Tests]
¥41,000

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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