1枚で3役！スフェロイド形成、ECMの組込み、薬物試験等を1つのプラットフォームで Apricell® 3-in-1 Plate　ハイドロゲルインサート入り 6wellプレート

3-in-1 プレートは、ハイドロゲル インサート入りの6 ウェル プレートで、 スフェロイド/オルガノイドの形成、細胞外マトリックス(ECM)の組込み、薬物試験等の下流の分析をすべて 1 つのプラットフォームで対応できます。 各インサートは 4 つの象限(円の4分の1の領域)に分かれており、1 つの象限あたり 6 つのスフェロイド/オルガノイドの形成が可能です。6 ウェル プレートでは 144 個のスフェロイド/オルガノイドに使用できます。 各象限は互いに分離されているため、 1 つのインサートに対して 4 つの異なる実験条件を実行できます。 ハイドロゲルは非細胞接着性ハイドロゲルです。

• 各アプリケーションごとに細胞の回収なしで、3次元培養、細胞外マトリックスの組込み、薬剤試験等の下流分析に対応
• スフェロイド/オルガノイドのサイズ分散が小さいため、実験の一貫性が向上
• マイクロウェルごとにスフェロイド/オルガノイドは 1 つのみ(モデル間のクロストークの可能性を排除)
• 培地交換が簡単(培地交換時にスフェロイドの吸引・破壊のリスクを低減)
• 細胞必要量が少ないため、事前の細胞継代は不要
• in situ 免疫染色およびイメージングと互換性あり

• Cell & ECM Seeding Protocol
• IHC Protocol
• Immunofluorescence Staining
• Invasion Protocol

補足情報

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スフェロイドの形成
3-in-1 プレートのマイクロウェルの形状と素材により、コンパクトで均一なスフェロイド/オルガノイドの形成が容易になります。ただし、すべての細胞がすぐに緊密なスフェロイドを形成するわけではありません。スフェロイドの形成に役立つヒントとテクニックがいくつかあります。具体的には、スフェロイドの播種密度、培地組成、培養期間を最適化するか、細胞外マトリックス (ECM) ハイドロゲルのオーバーレイを追加することで、より緊密なスフェロイドの形成を促進できます。

スフェロイドのサイズ
スフェロイドのサイズは、マイクロウェルのサイズ、細胞の種類、播種密度、および培養時間によって決まります。初期播種密度の最適化は、スフェロイドの初期形成能力に大きな役割を果たすだけでなく、スフェロイドを培養下に保持できる期間を決定します。より大きなスフェロイドは低酸素コアを形成し始める可能性がありますが、これは実験によっては望ましい場合とそうでない場合があります。

培地組成
培地の組成はスフェロイド形成に影響を与える可能性があります。これは各細胞タイプで検討する必要があります。

インサートの取り外し
インサートとウェルプレートのプラスチックの間の隙間にラボ用スパチュラを押し込みます。6 ウェル プレートの底に着いたら、ラボ スプーンを中心に向かって曲げます。この動きによりインサートがウェルから飛び出すはずです。ラボ用スパチュラでインサートをしっかりと支え、6 ウェル プレートから取り外します。

細胞外マトリックスの組込み
一部のアプリケーションでは、細胞外マトリックス (ECM) ハイドロゲルの追加が必要です。プライマリ ECM は、Cell & ECM Loading Zone に追加できます。共培養 (線維芽細胞や腫瘍細胞など) または 三重培養の場合、一次または二次 ECM オーバーレイを二次リザーバーに追加できます。ECM 濃度は特定の用途に合わせて最適化する必要があります。オルガノイド培養では通常、8 〜 10 mg/mL の濃度範囲の未希釈マトリゲル マトリックスが必要ですが、他のアプリケーションではさらに希釈した濃度が必要です。ECM を 3-in-1 プレートに追加する場合、ユーザーは ECM が過度に粘稠になっていないことを確認する必要があります。ECM はマイクロウェルにつながるマイクロチャネルを流れ下ることができなければなりません。ECM は、スフェロイドの形成中に、またはすでに形成されたスフェロイドへのオーバーレイとして追加できます。ECM を追加する前に培地を吸引する必要があります。これは、培地リザーバーおよび細胞および ECM ローディング ゾーンから培地を吸引することによって行うことができます。次に、残りのメディアが 3-in-1 プレートのハイドロゲルに吸収されるまで 3 〜 5 分間待ちます。

【スフェロイドの取り扱い】
培地/バッファー交換
3-in-1 プレートにより、培地交換時にスフェロイドを破壊したり吸引したりする可能性がなくなります。培地を交換するには、メディア リザーバーからピペットで取り出します。マイクロウェルに残った追加の培地は、細胞および ECM ローディング ゾーンからピペットで取り出すことができます。培地/バッファーを交換する際に培地を完全に吸引する必要はありません。

スフェロイドの転送
スフェロイドは、3-in-1 プレートから取り出すことなく、培養、細胞外マトリックスへの埋め込み、画像化、染色が可能で、薬剤スクリーニングに使用できます。ただし、必要に応じて、500 μL の培地でスフェロイドを静かに洗い流すことにより、スフェロイドを回収できます。

遠心分離
スフェロイドの形成やマイクロウェル内の中心合わせには遠心分離は必要ありません。

単一細胞の回収
単一細胞懸濁液を必要とするアッセイの場合、スフェロイドは、Accutase?、5 mM EDTA、1X Trypsin/EDTA、1X、5X、または 10X TrypLE TM、またはコラゲナーゼと一定量の 1X トリプシンの組み合わせなどの試薬とインキュベートすることにより、マイクロウェル内で解離できます。ユーザーは、適切な解離試薬をメディア リザーバーに追加し、インキュベーター内に置くことができます。次いで、細胞懸濁液をマイクロチャネルから吸引することができます。明視野顕微鏡を使用すると、解離した細胞をすべて確実に吸引するのに役立ちます。

• スフェロイドアッセイ
• ホモジニアスアッセイ
• 明視野イメージング
• 蛍光イメージング
• 免疫組織化学分析
• 共培養(Co-culture)
• 薬物スクリーニング
• 浸潤アッセイ

蛍光イメージング

図3. DAPI (青)、フィブロネクチン (赤)、およびE-カドヘリン (緑) で染色した膵臓/線維芽細胞を含む共培養腫瘍スフェロイドの蛍光イメージング

免疫組織化学分析

図4.
A)3-in-1 プレートでの神経膠芽腫腫瘍スライスの IHC 分析(腫瘍スフェロイドのノルマキシア条件下)
B)3-in-1 プレートでの神経膠芽腫腫瘍スライスの IHC 分析(体内の腫瘍状態をシミュレートするために低酸素状態に置かれた腫瘍スフェロイド)
C) HIF-1α は、哺乳動物細胞における低下した O ₂濃度下での転写因子の発現の定量

共培養

図5. 正常なヒト由来線維芽細胞を含むコラーゲン ECM に埋め込まれた SKOV-3 卵巣腫瘍スフェロイドの複数日間のイメージング

浸潤アッセイ

図6. 3-in-1 プレートの各マイクロウェルにつながるマイクロチャネルを通って ECM 内に浸潤する神経膠芽腫腫瘍スフェロイドの画像
腫瘍スフェロイドの浸潤長に対する薬物治療の効果は、明視野顕微鏡と蛍光顕微鏡で簡単に監視できる。

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