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研究用

コラーゲン量の測定に有用ヒドロキシプロリンアッセイ

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ヒドロキシプロリンアッセイキットは、タンパク質サンプル中のヒドロキシプロリン濃度を比色測定する定量的アッセイです。
酸加水分解サンプル中のヒドロキシプロリンは、Chlormine T との反応を介してピロールに変換された後、エールリッヒ試薬と反応して 540-560nm で検出可能な比色生成物を形成します(→ 測定原理を参照)。

測定されたヒドロキシプロリンレベルは、試料中に存在するコラーゲンの量に相関しているため、コラーゲン分解を伴う疾患を示すことができます。

背景

ヒドロキシプロリン測定とその意義とは?

ヒドロキシプロリン(hydroxyproline)は、プロリルヒドロキシラーゼによるプロリンの翻訳後修飾を介して不可逆的に合成されるアミノ酸の一種です。

ヒドロキシプロリンは、主にコラーゲン内にみられ、Gly-X-Y の繰り返し配列を有するコラーゲンの「Y」の位置に存在します。ヒドロキシプロリンは、コラーゲンらせん構造内にシャープなねじれを形成し、コラーゲンの安定化に寄与します。コラーゲンに加えて、プロリンのヒドロキシル化は、転写因子HIF-1(低酸素誘導因子)でも観察されます。通常の酸素条件下では、タンパク質EGLN1がHIF-1αの564番目のプロリン残基を水酸化修飾します。水酸化修飾されると、von Hippel-Lindau tumor suppressor(pVHL)によるユビキチン化を受け、HIF-1はプロテアソーム分解のために標的化されます。

ヒドロキシプロリンは、コラーゲン以外のタンパク質ではほとんど見出されないため、ヒドロキシプロリンの測定は、コラーゲンまたはゼラチン量を定量するためのマーカーとして使用されています。

また、ヒドロキシプロリンの測定は、コラーゲンの破壊を伴う特定の疾患を同定するために使用されてきました。例えば、コラーゲン量の増加は、骨ページェット病(Paget’s Bone Disease)の血清中で測定されます。また、ヒドロキシプロリン量の増加は、前立腺癌の骨転移、肝線維症、ならびにメラミンおよびシアヌル酸誘発性の腎毒性と相関しています。

特長

  • 血清、血漿、ライセート、および尿サンプルに適用
  • 検出限界:約47.5 µM ヒドロキシプロリン
  • ヒドロキシプロリンスタンダードが付属

構成内容

  • ヒドロキシプロリンスタンダード
  • アッセイバッファー
  • Chloramine T 試薬
  • 2X Ehrlich’s Concentrate
  • Ehrlich's Diluent

測定原理

ヒドロキシプロリンの測定原理
図1.ヒドロキシプロリンアッセイの原理

Cell Biolabs社のヒドロキシプロリンアッセイキットは、組織、血漿、血清、または尿の酸加水分解物から総ヒドロキシプロリンを定量する比色アッセイです。

まず、未知サンプルまたはヒドロキシプロリンスタンダードを96ウェルプレートに添加します。

続いて、クロラミンT 混合液(Chloramine T)を加え、ヒドロキシプロリンをピロール(pyrrole) に変換します。最後に、エールリッヒ試薬としても知られるDMAB(4-(Dimethylamino)benzaldehyde)混合液をウェルに添加すると、ピロールと反応して比色生成物が生じ、これをマイクロプレートリーダーで測定します(540-560 nm)(図1)。

未知のヒドロキシプロリン量は、既知量のヒドロキシプロリン測定結果から作成したスタンダードカーブと比較して算出します。

プロトコール

  1. 使用前に全ての試薬を混合、調製します。
    (サンプルおよびスタンダードの各試料は二連でのアッセイを推奨します。)
  2. 96ウェルマイクロプレートに、酸加水分解サンプル(各サンプルの調製方法はデータシートを参照)を10 μL 添加します。
    Note: If needed, unknown samples may be diluted in water. If an oven is not available for incubating microplates at 60℃, use microcentrifuge tubes for the assay and incubate in a waterbath. Transfer 150 µL of the final colorimetric reaction (after step 8 below) to a microplate for final absorbance reading.
  3. 真空下、60〜80℃で30〜45分間、酸加水分解サンプルを蒸発させます。
    Note: Unknown samples must be dried to remove any residual HCl that could inhibit the colorimetric assay reaction.
  4. 各ウェルまたはチューブに、ヒドロキシプロリンスタンダードを10 μL 添加します。
  5. 各ウェルまたはチューブに、クロラミンT 混合液を100 μL 添加します。
  6. 室温で30分間インキュベートします。
  7. 各ウェルまたはチューブにエールリッヒ試薬(Ehrlich’s Reagent)を 100 µL 添加します。
  8. 60℃で、90分間インキュベートします。
  9. マイクロプレートリーダーで吸光度を測定します。(540〜560 nm)

使用例

ヒドロキシプロリンスタンダードカーブ
図2.ヒドロキシプロリンスタンダードカーブ

ヒト血清中のヒドロキシプロリン検出
図3.ヒト血清中のヒドロキシプロリン検出
プールしたヒト血清(またはネガティブコントロールの水)は、データシート記載の方法に従って酸加水分解処理した。

ヒドロキシプロリンアッセイ

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Hydroxyproline Assay Kit詳細データ CBL STA-675 96 ASSAY
¥82,000
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