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生細胞中の過酸化水素を簡便に測定可能 Amplite™ 細胞内過酸化水素蛍光測定キット（緑色蛍光）

メーカー名：AAT Bioquest, Inc. (Former ABD Bioquest, Inc.)

本商品は、生細胞中の過酸化水素（H₂O₂）を蛍光で検出するキットです。

背景

過酸化水素（H₂O₂）は反応性の高い酸素代謝副産物であり、多くの酸化ストレスに関連する状況において重要なレギュレーターとして働きます。また喘息やアテローム性動脈硬化症、糖尿病性血管障害、骨粗しょう症、神経変性疾患、ダウン症候群などに影響しています。
抗体が酸素分子を過酸化水素に変換する能力を持ち、免疫システムにおける認識と分解に貢献しているとする最近の報告は、過酸化水素生物学の最も興味深い一面でもあり、この反応性の高い活性酸素種を測定することで、酸化ストレスがどのように細胞内パスウェイを調整しているかを決定するのに役立つ可能性があります。

使用目的

本商品では、独自のAmplite™ Green 過酸化水素センサー（Ex/Em 490/525 nm)で生細胞中の過酸化水素を定量します。Amplite™ Green 過酸化水素センサーは細胞透過性があり、過酸化水素と反応して緑色の蛍光を示します。

構成内容

Component A: 250× Amplite™ Green 過酸化水素センサー
Component B: H₂O₂（過酸化水素）
Component C: アッセイバッファー
Component D: DMSO

プロトコール

ストック溶液の調製

Amplite™ Green 過酸化水素センサー（250×）：Component Aに50 mLのDMSO（Component D）を加えます。
20 mM H₂O₂ストック溶液：22.7 mLの3% H₂O₂（0.88M, Component B）を977 mLのアッセイバッファー（Component C）に加えます。

1× Amplite™ Green 過酸化水素センサーワーキング溶液の調製

20 mLのAmplite™ Green 過酸化水素センサー（250×）を5 mLのアッセイバッファーに加えます。

H₂O₂スタンダードの調製（0-1000 µM）

50 µLの20 mM H₂O₂溶液を950 µLのアッセイバッファーに加え、1000 µM H₂O₂溶液を調製します。
1000 µM H₂O₂溶液を200 µL取り、1:3で連続希釈します（300、100、30、10、3、1、0.3、0 µL）。
50 µLのサンプル溶液（またはスタンダード溶液）を黒色96ウェルプレートに加えます。
ブランクのウェルには50 µLのアッセイバッファーを加えます。

上清でのH₂O₂アッセイ

50 µLの1× Amplite™ Green 過酸化水素センサーワーキング溶液を各ウェルに加えます。各ウェルのトータル液量は100 µLになります。
遮光し、室温で15-30分間インキュベートします。
蛍光増加をプレートリーダーでモニターします。

生細胞でのH₂O₂アッセイ

細胞を活性化します。
PBSバッファーで細胞を洗浄し、1× Amplite™ Green 過酸化水素センサーワーキング溶液100 µL/ウェルで細胞を5-60分間インキュベートします。
蛍光増加をプレートリーダーでモニター（Ex/Em ＝ 490/525 nm、Bottom read mode）、
またはFITCチャンネルにて蛍光顕微鏡で蛍光変化をイメージングします。