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記事ID : 17168
研究用

生細胞中の過酸化水素を簡便に測定可能Amplite™ 細胞内過酸化水素蛍光測定キット(緑色蛍光)

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本商品は、生細胞中の過酸化水素(H2O2)を蛍光で検出するキットです。

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背景

過酸化水素(H2O2)は反応性の高い酸素代謝副産物であり、多くの酸化ストレスに関連する状況において重要なレギュレーターとして働きます。また喘息やアテローム性動脈硬化症、糖尿病性血管障害、骨粗しょう症、神経変性疾患、ダウン症候群などに影響しています。
抗体が酸素分子を過酸化水素に変換する能力を持ち、免疫システムにおける認識と分解に貢献しているとする最近の報告は、過酸化水素生物学の最も興味深い一面でもあり、この反応性の高い活性酸素種を測定することで、酸化ストレスがどのように細胞内パスウェイを調整しているかを決定するのに役立つ可能性があります。

使用目的

本商品では、独自のAmplite™ Green 過酸化水素センサー(Ex/Em 490/525 nm)で生細胞中の過酸化水素を定量します。Amplite™ Green 過酸化水素センサーは細胞透過性があり、過酸化水素と反応して緑色の蛍光を示します。

構成内容

  • Component A: 250× Amplite™ Green 過酸化水素センサー
  • Component B: H2O2(過酸化水素)
  • Component C: アッセイバッファー
  • Component D: DMSO

プロトコール

ストック溶液の調製
  1. Amplite™ Green 過酸化水素センサー(250×):Component Aに50 mLのDMSO(Component D)を加えます。
  2. 20 mM H2O2ストック溶液:22.7 mLの3% H2O2(0.88M, Component B)を977 mLのアッセイバッファー(Component C)に加えます。
1× Amplite™ Green 過酸化水素センサーワーキング溶液の調製
20 mLのAmplite™ Green 過酸化水素センサー(250×)を5 mLのアッセイバッファーに加えます。
H2O2スタンダードの調製(0-1000 µM)
  1. 50 µLの20 mM H2O2溶液を950 µLのアッセイバッファーに加え、1000 µM H2O2溶液を調製します。
  2. 1000 µM H2O2溶液を200 µL取り、1:3で連続希釈します(300、100、30、10、3、1、0.3、0 µL)。
  3. 50 µLのサンプル溶液(またはスタンダード溶液)を黒色96ウェルプレートに加えます。
    ブランクのウェルには50 µLのアッセイバッファーを加えます。
上清でのH2O2アッセイ
  1. 50 µLの1× Amplite™ Green 過酸化水素センサーワーキング溶液を各ウェルに加えます。各ウェルのトータル液量は100 µLになります。
  2. 遮光し、室温で15-30分間インキュベートします。
  3. 蛍光増加をプレートリーダーでモニターします。
生細胞でのH2O2アッセイ
  1. 細胞を活性化します。
  2. PBSバッファーで細胞を洗浄し、1× Amplite™ Green 過酸化水素センサーワーキング溶液100 µL/ウェルで細胞を5-60分間インキュベートします。
  3. 蛍光増加をプレートリーダーでモニター(Ex/Em = 490/525 nm、Bottom read mode)、
    またはFITCチャンネルにて蛍光顕微鏡で蛍光変化をイメージングします。

製品データ

CHO-K1の生細胞のイメージング

図2. CHO-K1 生細胞のイメージング
A:コントロール B:室温で5分間100 µM H2O2で処理した細胞
検出感度は3 µM H2O2です。

参考文献

参考文献はコチラ

Amplite™ 細胞内過酸化水素蛍光アッセイキット(緑色蛍光)

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Cell MeterTM Intracellular Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Green Fluorescence*詳細データ ABD 11503 1 KIT
[200 Tests]
¥51,000

製品使用文献

  1. Lei Rong, Chi Zhang, Qi Lei, Ming-Ming Hu, Jun Feng, Hong-Bing Shu, Yi Liu, and Xian-Zheng Zhang. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regen Biomater. published 11 June 2016, 10.1093/rb/rbw022
  2. F Nagata, S Ito, K Itoga, HK and Hitoshi Masaki. The Mechanism of Melanocytes-Specific Cytotoxicity Induced by Phenol Compounds Having a Prooxidant Effect, relating to the Appearance of Leukoderma. Biomed Res Int. 2015; 2015: 479798. Published online 2015 Mar 12. doi: 10.1155/2015/479798
  3. Ma HP. Hydrogen peroxide stimulates the epithelial sodium channel through a phosphatidylinositide 3-kinasedependent pathway J Biol Chem. 2011, 286(37):32444-53. doi: 10.1074/jbc.M111.254102.
  4. Uemura T, Watanabe K, Ishibashi M, Saiki R, Kuni K, Nishimura K, Toida T, Kashiwagi K, Igarashi K. Aggravation of brain infarction through an increase in acrolein production and a decrease in glutathione with aging. Biochem Biophys Res Commun. 2016 Mar 29. pii: S0006-291X(16)30449-1. doi: 10.1016/j.bbrc.2016.03.137.
  5. Ying-Yao Quan, Gui-Qi Qin, Hao Huang, Yu-Hong Liu, Xiao-Ping Wang, Tong-Sheng Chen. Dominant roles of Fenton reaction in sodium nitroprusside-induced chondrocyte apoptosis. Free Radical Biology and Medicine. Available online 24 February 2016.
  6. Aravind T. Reddy, Sowmya P. Lakshmi, Jennifer M. Kleinhenz, Roy L. Sutliff, C. Michael Hart, and Raju C. Reddy. Endothelial Cell Peroxisome Proliferator– Activated Receptor Reduces Endotoxemic Pulmonary Inflammation and Injury. J. Immunol., Dec 2012; 189: 5411 - 5420.

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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