細胞融解から数日以内で試験に使用可能
ioGlutamatergic Neuronsは細胞融解後に急速かつ均一にニューロン表現型を獲得します。
Day 1
Day 4
Day 7
Day 11
ioGlutamatergic Neuronsは急速に成熟してグルタミン酸作動性ニューロンの形態を示し、細胞融解後11日間で構造的なニューロンネットワークが形成された。
動画:ioGlutamatergic Neurons(分化・成熟の様子)
MAP2
VGLUT2
DAPI
MERGE
細胞融解後11日目のioGlutamatergic Neuronを用いて免疫蛍光染色を実施した結果、汎ニューロンタンパク質であるMAP2とグルタミン酸作動性ニューロン特異的なトランスポーターであるVGLUT2が均一に発現していた。
ioGlutamatergic Neuronsは、ヒト iPSC 由来のアストロサイトとの共培養におけるMaxTwo HD-MEA システムによる軸索トラッキングアッセイ(左)では、ニューロン活動電位が細胞体から遠位の軸索枝まで空間的に伝播する様子を明らかにした。軸索の全長(中央)と発火率(右)は時間の経過とともに増加していたことから、細胞の成熟が進んでいることが示された。
データ提供:Charles River Laboratories・MaxWell Biosystems
ロット間の高い一貫性
ioGlutamatergic Neurons の異なる3ロットにおいて、細胞融解後0日目、11日目、18日目にバルクRNAシーケンス解析を実施した結果、ロット間の高い一貫性が示された。
(A) 3つの異なる製造ロット間の遺伝子発現の変動を評価する主成分分析 (PCA) の結果。
(B)親株の非誘導hiPSCサンプルを除外したPCA解析の結果。
(C) 11日目時点での3つの異なるロット間における差次的発現試験において、統計的に有意な差次的発現 (DE) 遺伝子は検出されなかった (|logFC| > 0.5 および FDR < 0.01)。
スクリーニング用途に適した、堅牢かつスケーラブルな細胞
細胞融解後9日目の384ウェルプレート上のioGlutamatergic Neuronsに対し、ツール化合物を処置し、細胞毒性測定用のCellTiter-Glo®(CTG)アッセイ、ならびにAKTセリン/スレオニンキナーゼ1(AKT)およびハンチンチン(HTT)タンパク質を標的としたTR-FRET(HTRF®)アッセイを実施した。3つのアッセイ全てにおいて濃度反応曲線が得られた。
mRNAトランスフェクションにも対応
ioGlutamatergic Neuronsにおいて、トランスフェクション効率の評価、およびトランスフェクションプロトコルによる潜在的な細胞毒性の影響を評価した結果、GFPをコードするmRNAが効率的にトランスフェクションされ、持続的な長期発現を示すことが確認された。
各種io Cells細胞との共培養に対応
ioMicrogliaとの共培養
ioMicrogliaはioGlutamatergic Neuronsとの共培養においてネットワーク活動を強化します。
Incucyte® Neuroburst Orange Lentivirus を発現する ioGlutamatergic Nuronsを、単独培養、またはioMicroglia Male (品番:io1021)と共培養し、Incucyte® Neuronal Activity Analysis ソフトウェアを使用してモニタリングおよび定量化した。
(A) ミクログリア添加後15 日目に各培養条件で示された代表的なカルシウムトレース。
(B) ミクログリア添加後15日目のネットワーク相関と平均バースト持続時間を示す棒グラフ
(データは平均±SEM、n = 3〜12の反復実験)。
GFP ioMicrogliaとの共培養
ioGlutamatergic NeuronsとGFP ioMicrogliaを共培養し、生細胞イメージングを実施すると、GFP ioMicrogliaの分布を明瞭に可視化することが可能です。
細胞融解後11日間培養したioGlutamatergic Neurons に、細胞融解後10日間培養したGFP ioMicroglia (品番:io1096)を直接添加し、3日間共培養を実施した後、Leica DMi8 を用いて生細胞イメージングを行った。明視野画像と蛍光画像を合成したところ、共培養物中の GFP ioMicrogliaの分布を容易に確認できた。
ioGABAergic Neurons、ヒトiPS由来アストロサイトとの共培養
ioGABA作動性ニューロンは、共養物中の興奮性のioGlutamatergic Neuronsに対して抑制効果を発揮し、ネットワークバースト率を高めます。
ioGlutamatergic Neurons、ioGABAergic Neurons(品番:io1003)、ヒトiPS由来アストロサイトの3つの細胞を共培養し、MEA分析を実施した。三培養物におけるioGABAergic Neuronsの追加数の増加は、ネットワークバーストあたりのスパイク数を減らし、ネットワークバースト率の増加にしたことから、ioGABAergic Neuronsが興奮性のioGlutamatergic Neuronsに対する抑制効果を発揮していた。
ioOligodendrocyte-like cellsとの共培養
ioGlutamatergic NeuronsとioOligodendrocyte-like cellsを1または100 ?M db-cAMPを含む培地で共培養し、14日目および21日目にMBP(緑)およびTUBB3(赤)、核をDAPI(青)で対比染色した。