生細胞ベースのタンパク質発現システムです In Vivo LEXSY

生細胞ベースのタンパク質発現システムIn Vivo LEXSYをご紹介致します。In Vitro LEXSYに対し、大容量でのタンパク質発現に適しています。

LEXSYタンパク質発現システム

LEXSYタンパク質発現システムには、「生細胞ベースの発現系（In Vivo LEXSY）」と「細胞フリー翻訳システム（In Vitro LEXSY）」があります（表1）。（細胞フリー翻訳システム In Vitro LEXSY）

• ［In Vivo LEXSY］は、L. tarentolae 発現株の構築が必要です。
  安価な培地で培養でき、リコンビナントタンパク質が高収量で得られます。
• ［In Vitro LEXSY］は、目的の遺伝子（PCR産物またはDNAベクターにサブクローニングしたもの）から直接タンパク質を産生できます。多数のタンパク質を同時に超高速で産生できますが、アップスケールには限界があります。

表1　In Vivo / In Vitro LEXSY の比較

2種類のシステム

［In Vivo LEXSY］は、恒常的発現とTet誘導発現の2つのシステムが利用できます。

■ 恒常発現用LEXSY

恒常発現用LEXSYは、基本的な構造で、多種多様なタンパク質を効率的に産生できます。

タンデム18S rRNAをコードする染色体のssu遺伝子座に、発現カセットを組込むことがベースになっています。（図1）。このクラスターは、一般的な真核生物発現系で使用されるRNAポリメラーゼIIより10倍強力な、宿主のRNAポリメラーゼIによって転写が行われます。RNAポリメラーゼIの発現プロファイルにより、ターゲットタンパク質の発現は培養細胞の増殖と平行します。

図1　恒常発現用LEXSYの組込みによるクローニング。
LEXSY宿主にトランスフェクションを行うと、ターゲット遺伝子を運ぶ直線化された発現カセットが、相同組換えによって、タンデムに並ぶ18S rRNA遺伝子（ssu）に組込まれる。安定的にトランスフェクトされた発現株は、作動可能にリンクした抗生物質耐性マーカーで選択する。4種類の抗生物質耐性マーカーを利用可能（表2）。

■ Tet誘導LEXSY

Tet誘導LEXSY（図2）は、よく知られているT7発現システムに類似しており、タンパク質発現の厳格な制御が可能です。

発現は、誘導物質（テトラサイクリン）の添加によって開始されるので、発現タンパク質が宿主に対して毒性を示す可能性を軽減できます。また、いくつかの細胞内タンパク質は、誘導発現を使用すると、恒常的発現よりも5-10倍多く産生されることが示されました。誘導システムであるpLEXSY_I-blecherryは、ブレオマイシン耐性遺伝子とCherry蛍光タンパク質遺伝子を機能的に融合させたものを含んでいます。このシステムは、抗生物質による選択の他、日光下で色の強度によるスクリーニングを行ったり、簡単なCherry蛍光測定によってオンラインで発現をモニターしたりすることが可能です（図4）。このことは、培養プロセスで細胞の回収条件を最適化する際に、特に重要になります。Tet誘導LEXSYには、組込みバージョンとエピソームバージョンの二種類があります。組込みバージョンでは、発現カセットが染色体のオルニチン脱炭酸酵素（odc）遺伝子座に安定して組込まれています。エピソームバージョンでは、自己複製能を持つエピソームとして染色体外に維持される、発現プラスミドの増殖とオリゴマー形成を利用します(Kushnir et al. 2011)。

図2　Tet誘導LEXSYの構造。
LEXSY宿主T7-TRは、ssu遺伝子座からT7 RNAポリメラーゼとTetリプレッサーを恒常的に発現する。発現カセットをトランスフェクションすると、ターゲット遺伝子がT7プロモーターとTetオペレーターの制御下で誘導的に発現する。詳細については本文を参照。

■ In Vivo LEXSYの構成

恒常発現用システムとTet誘導システムのどちらも、単純にクローニングの方法を選ぶだけで（図3）、同じベクターからタンパク質の細胞内発現と分泌発現を行うことが可能です（図6）。

分泌発現は、ジスルフィド結合の形成やグリコシル化など、翻訳後修飾を受けるタンパク質発現に推奨しています。LEXSYシステムでは、非常に均一な哺乳動物型のN-グリコシル化が行われることが示されています（Breitling et al. 2002）。

抗生物質選択マーカーを4種類利用可能なことから、恒常発現用LEXSYでは最大4つ、Tet誘導LEXSYでは最大2つまでのターゲットタンパク質を共発現できます（表2）。マルチサブユニットタンパク質の発現(Phan et al. 2009, Figure 16)、in vivoでのタンパク質相互作用の研究、ターゲット遺伝子の複数のコピーの共発現などの目的に、特に有用にご使用いただけます。

図3　フレキシブルなLEXSYのタンパク質発現プラットフォーム
4種類のIn Vivo LEXSY全てにおいて、SDS-PAGE分析が示すように、リコンビナントタンパク質が効率的に産生された。恒常発現用LEXSYの使用で、ターゲットタンパク質Aは、細胞抽出物から従来の二段階クロマトグラフィーで純度95%まで精製された。また、タンパク質Bは、培養上清からワンステップのアフィニティーでほぼ均一に精製された。ターゲットタンパク質を過剰に分泌発現させると、ほぼターゲットタンパク質のみが培地に分泌された（タンパク質B、C、F、G）。さらに、Tet誘導LEXSYの使用で、タンパク質発現が最大100倍まで誘導された（タンパク質D、E）。中央の写真は浮遊培養中のL. tarentolae細胞。

表2　In Vivo LEXSYの構成
[1] 4種類の抗生物質が使用可能 (LEXSY NTC, LEXSY Hygro, LEXSY Bleo, LEXSY Neo)
[2] 2種類の抗生物質が使用可能 (LEXSY Bleo, LEXSY Neo)

（1）Tet誘導タンパク質発現システム

図4　Tet誘導タンパク質発現システム pLEXSY_I-blecherry3は、ターゲットタンパク質とBleCherryタンパク質のバイシストロニックな共発現を利用している。
行1： LEXSY発現プラスミドは、pLEXSY_I-blecherry3発現ベクター（品番：EGE-243）に、目的の遺伝子を挿入して構築する。発現プラスミドを直線化し、T7 RNAポリメラーゼとTetリプレッサーを発現しているLEXSY宿主T7-TRにトランスフェクトする。リコンビナントクローンを、LEXSY BHIアガー上でLEXSY Bleoを使用して選択する。日光の下でcherry色のクローンを識別し、誘導物質テトラサイクリンを添加したアガープレート上にニトロセルロース膜をトランスファーし、コロニーリフト法によりプレスクリーニングする。さらなるスクリーニングのために、最もcherry色の強いクローンを小規模な浮遊培養で増殖させる。
行2： テトラサイクリンで48時間誘導した後、24ウェルフォーマットの蛍光測定で、最も発現量の高いクローンを識別する。最も生産的なクローンを、10-500mL培養にスケールアップして増殖させる。
行3： タンパク質を大量精製するために、大規模培養（10-30L規模）を行う。最適な回収時間を培養サンプルのオンライン蛍光測定で決定する。最適なタイミングで細胞を回収し、ターゲットタンパク質をアフィニティークロマトグラフィー等で精製する。

（2）リコンビナントLEXSYにおけるin vivoでのビオチン化−最初の証拠

ビオチンとストレプトアビジンは非常に高い親和性（pMレンジ）があります。タンパク質のビオチン化は、選択性が高く交差反応が少ないことから、検出や精製などの生化学アッセイにおいて、強力なツールとなります。タンパク質のビオチン化は、in vitroでは精製タンパク質に対して、in vivoでは生合成中に行われます。

今回、真核生物タンパク質発現システムのLEXSYを使用して、in vivoでビオチン化リコンビナントタンパク質が効率的に産生できることを、Klatt et al.（2013）が初めて示しました。筆者らは、異種のビオチンリガーゼであるBirAを発現する、新しいLEXSY宿主株を構築しました。BirAは、LEXSY発現プラスミドによってコードされるアミノ酸13個から構成されるビオチンアクセプター配列（Aviタグとしても知られている）の、部位特異的なビオチン化を行います（図1）。この改変されたLEXSY宿主株は、代謝変化や形態異常を示さず、有意なオフターゲット効果は見られませんでした。

ターゲットタンパク質として、p53、ポリユビキチン（Ubi8）、ファルネシル二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ（FDFT1）、キネシンのシステインフリー変異体（mTKIN）を使用すると、共発現と効率的なビオチン化が起こりました。また、ビオチン化ヒトp53は生物学的に活性があり、哺乳類細胞におけるp53の役割通りに、オートファゴソーム様構造のきっかけとなりました。

図5　LEXSYを使用した、リコンビナントタンパク質のin vivoにおける部位特異的ビオチン化
アミノ酸13個から構成されるAviタグ配列中のリジンが、改変されたLEXSY宿主株のBirAによって特異的にビオチン化される。ビオチン化は位置特異的ではないため、Aviタグはターゲットタンパク質のN末端とC末端のどちらにでも配置できる。モノビオチン化されたタンパク質は、ビオチンとストレプトアビジンの高い親和性（pMレンジ）によって、検出や精製を行うことができる。

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