Viability PCRでのPMA™ およびのPMAxx™の光分解用に PMA-Lite™ LED 光分解装置 (Ver2.0)

本装置は、Viability PCR アプリケーションにおいてプロピジウム モノアジド (PMA)、PMAxx™またはエチジウム モノアジド (EMA)で処理されたサンプルの最適な光活性化のために特別に設計された軽量 LED ライト ボックスです。

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微生物の生存率を迅速かつ高感度に分析するためのViability PCR

Viability PCR (v-PCR) は、qPCR ベースのメソッドの特異性と感度を、PMAxx™、PMA、またはEMAなどの死細胞選択的 DNA 結合色素と組み合わせたものです。この技術は非常に汎用性が高く、多数の細菌、真核生物、ウイルス、古細菌に適用できます。

PMAxx™ および PMA は、Biotium社によって開発された光反応性色素で、培養ベースの方法や代替の EMA v-PCR 色素よりも優れた死細胞選択性を備えています。PMAxx™ および PMA色素は、強い可視光にさらされると、dsDNA と共有結合架橋を形成します。死んだ微生物と生きた微生物を区別する基礎となるメカニズムは 2 つあります。色素に架橋された DNA は効率的に増幅されず、DNA 単離中に沈殿するため、修飾された DNA の回収率が低くなります。色素は細胞膜を透過しないため、生菌と死菌の両方を含むサンプルを色素で処理すると、細胞膜が損傷した死菌のみが DNA 修飾を受けやすくなります。リアルタイム PCR 反応では、死細胞 DNA は生細胞 DNA よりも遅延した増幅と高い Ct を示します。 v-PCR は細菌の生存率の定量を可能にし、複雑な菌株、混合菌株、または生存しているが培養不可能なサンプルに対して使用できます。

図1. 原理
PMAやPMAxxのようなViability PCR用の色素は膜不透過性であるため、死細胞由来のDNAと選択的に反応する。強い可視光線（PMA-Liteによる光照射）にさらされると、色素は反応性になりDNAに共有結合する。PMA/PMAxxが共有結合したDNAはPCR反応における増幅を妨げる。(使用例は図2と図3を参照)

本装置は、PMA、PMAxx™、またはその他の光反応性色素で処理されたViability PCR サンプルの光活性化のために制御された照射を一貫して行うことができます。最大 18 個のチューブに均一かつ最大限の照明を提供するように配置された複数の LED ライトが含まれており、光活性化期間の柔軟性を高めることに加えて、プログラミングとモニタリングに最適な直感的タッチ スクリーンを搭載することで、以前の PMA-Lite™ LED 光分解装置の改良版として設計されています。

• 18本のチューブを均一かつ最大限に照射
• 内臓ファンで温度を37℃以下に維持
• 5〜45分の間で1分間隔でタイマーを設定可能
• ユニバーサルに使用できるコンセントアダプターが付属

図2. 本装置で光活性化を行った生菌（Live）または熱処理をした死菌（Dead）由来のB. subtilis DNAのリアルタイムPCR増幅曲線
各サンプルは25 uMのPMAまたはPMAxxと混合した後、PMA-Liteで処理した。その後DNA精製を行ったサンプルをB. subtilisに対するプライマーを用いてリアルタイムPCRを行った。PMA-LiteによるPMA/PMAxxの光活性化処理は、生菌由来のDNAの増幅には影響しなかったが、死菌由来のDNAの増幅におけるサイクル数の増加（DNAの増幅量の減少）を引き起こした。

図3. 本装置によるPMAの光活性化の有無によるCt値の変化
Staphylococcus epidermidisの生菌（Live）または熱処理をした死菌（Killed）にPMAを投与した後、PMA-Liteによる光活性化を行うサンプルと行わないサンプル両方を用意した。各サンプルについてStaphylococcus epidermidisに対するプライマーを用いてリアルタイムPCRを行った。光活性化ありのサンプルでは生菌と死菌でCt値の差が出たが、光活性化なしのサンプルでは差が出なかった。PMAはPMA-Liteによる光活性化が必要であることを示している。

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