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研究用

Power Styramide™ Signal Amplification (PSA™)

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Power Styramide™ Signal Amplification (PSA™)とは

Power Styramide™ Signal Amplification (PSA™) は、細胞や組織内に少量しか存在しない標的を検出するための新規酵素増幅法です。
優れた明るさと光安定性をもつiFluor™色素 とポリHRP媒介性PSA™画像処理を組み合わせることで、従来型の免疫組織化学、免疫細胞化学、およびin situハイブリダイゼーション技術に比べ100倍以上の高い精度と感受性をもった明るい蛍光シグナルを産生します。

原理

PSA™画像処理では、チラミドシグナル増幅(TSA)と同様に、分析物依存性レポータ酵素である西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を用いてin situにおける共有結合性析出の触媒や標的タンパク質、核酸配列への標識Styramide™基質の結合を行います。過酸化水素(H2O2)存在下において、HRPは標識Styramide™基質を非常に反応性が高く短命なStyramide™ラジカルへ変換し、これが迅速に酵素部位上またはその付近のチロシン残基に結合します。Styramide™ラジカルはチラミドラジカルに比べて反応性がより高いことから、PSA™による画像処理は従来型のTSA標識に比べて著しく迅速、より頑強、かつ高感度です。また、添加した標識Styramide™はHRP標的部位付近に析出することから、拡散による解像度の低下はほとんどありません。PSA™画像処理技術は、IHC、ICC、IF、in situハイブリダイゼーションおよびELISAなどの、HRPを組み込むことができる様々な実験手法に簡単に追加することができます。

標的抗原の免疫標的に応用するPSA(TM)検出方法の模式図

図1 標的抗原の免疫標的に応用するPSA™検出方法の模式図
従来型の検出法を使用すると、細胞や組織サンプルが無標識の一次抗体とHRP-二次抱合体にプローブされる。
HRPは標識Styramide™から高い反応性をもつStyramide™ラジカルへの変換を触媒し、このラジカルは酵素部位上およびその付近のチロシン残基に共有結合する。

特徴

Power Styramide™ Signal Amplificationは、HRP標識ごとに複数のStyramide™ 基質が迅速に触媒され、共有結合性の析出が生ずることを利用し、単純、高い感度と特異性、および他の技術との互換性といった利点があります。Styramide™ラジカルは、高い反応性を持つことから、HRP-標的相互作用部位においてStyramide™を頑強で迅速に標識することができるため、TSAに比べてより強力なシグナル強度とより良い空間的解像度が得られます。

  • 低発現ターゲットを超高感度検出。IHC、ICC、およびIF手法に比べて100倍高感度
  • 高い蛍光強度(チラミドに比べ10-50倍高い)
  • マルチプレックス分析用に、他の蛍光マーカー、染色技術、およびPSA™画像処理キットと互換性あり
  • より高い反応性をもつPSA™ラジカルにより、迅速な結果と放射測定法と同等の感度や解像度
  • 貴重な抗体を温存、PSA™標識で同等レベルの感度を獲得しつつ一次抗体の使用量を著しく低減
  • PSA™画像処理キットは簡単に使用でき、1キット約100test分

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iFluor&tarde; 594 Styramide&tarde; (Cat No. 45035)

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Alexa Fluor® 594 tyramide

図2 ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋サンプルのPSA™とTSA増幅手法を用いた蛍光IHC
ヒト肺腺がん陽性組織切片をEpCam-抗マウス抗体で染色後、それぞれiFluor 594™ PSA™ Imaging Kitおよびヤギ抗-マウスIgG(Cat No. 45290)を用いたPSA™手法またはAlexa Fluor® 594 チラミドを用いたTSA手法により染色した。画像はTRITCフィルターセットを用いて同一暴露時間において取得した。核はNuclear Blue™ DCS1 (Cat No. 17548)を用いて対比染色した。

優れた検出感度

PSA™イメージングにより感度が増強することから、免疫染色においてはアッセイ感度に影響を及ぼすことなく一次抗体希釈率を上げることができます。これにより、非特異的バックグラウンドシグナルを低減でき、固定化処理の不足や標的物発現レベルが低いことによる不十分な免疫標識を防ぎます。

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図3 Power Styramide™ Signal Amplification (PSA™) Kitsの感度
HeLa細胞を固定後、透過処理し、様々な濃度のチューブリン-抗ウサギ一次抗体で標識した。販売元の推奨濃度は1:500希釈または2 μg/mlである。その後、細胞をiFluor™ 488 PSA™ Imaging Kitおよびヤギ抗-ウサギIgG抗体、Alexa Fluor® 488-標識チラミド、またはAlexa Fluor® 488-標識ヤギ抗-ウサギIgGで染色した。処理ごとに細胞画像を同一条件下で取得(FITCフィルターセットを用いて同一暴露時間で分析)した。相対的蛍光シグナル強度を測定し異なる検出法間の比較を行った。

PSA™を用いたマルチプレックス

PSA™システムは、他の蛍光マーカー、細胞および組織染色技術、および他の画像キットと併用できるよう設計されており、複数の標的を同時に可視化できます。また、TSAや蛍光二次抗体に比べてPSA™の検出閾値が低いことから、同一宿主生物より産生された一次抗体を用いて2種の標的が検出でき、シグナル間のクロストークもほとんどありません。PSA™画像処理は以下のものと互換性があります。

  • 蛍光マーカーと対比染色(例:DAPI、Hoechsts)
  • 蛍光タンパク質(例:GFP、YFP、RFP)
  • 他のStyramide™ 試薬
  • 他のPSA™ 画像処理イメージングキット
  • チラミド試薬とチラミド画像処理キット

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iFluor™ 488 PSA™ Kit (Cat No. 45205)

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iFluor™ 555 PSA™ Kit (Cat No. 45270)



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DAPI (Cat No. 17507)

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Merged

 

図4 ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋ヒト肺腺がんのiFluorA™ PSAA™ Imaging kitを用いた連続的な免疫染色
EpCamをEpCam-抗ウサギ抗体とiFluor™ 488 PSA™ Imaging Kit (Cat No.45250) および抗ヤギ-ウサギIgGで標識後、洗浄した。パンケラチンはパンケラチン-抗マウス抗体と iFluor™ 555 PSA™ Imaging Kit (Cat No. 45270) および抗ヤギ-マウスIgGで標識した。核はDAPI (Cat No. 17507) で標識した。画像は共焦点顕微鏡で取得した。

自由度の高い作業の流れ:IHC、ICC、ISH & フローサイトメトリに対応

PSA™画像処理技術は、使用する手法のプロトコールにHRPを加えることができ、サンプル種や免疫学的な手法において一般的に使用される蛍光画像処理プラットフォームに対応できるのであれば、どのようなアプリケーションにも適合します。PSA™ 画像処理を従来型のIHC、ICC、ISH、およびFCと組み合わせると、画像解像度の低下やバックグラウンドノイズを増大させたりすることなく、検出感度を著しく向上できます。

免疫細胞化学(ICC)

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図5 HL-60細胞のCD45表面受容体染色
HL-60細胞を4%ホルムアルデヒドで固定し、透過処理後、0.2 μg/mL 抗-CD45 一次抗体で標識した。その後、細胞をiFluor™ 647 Styramide™で染色し、Cy5フィルターセットを用いて蛍光画像を取得した。

 

In Situ ハイブリダイゼーション (ISH)

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図6 ビオチン化PNAプローブを用いたin situハイブリダイゼーションによるパンセントロメア染色
Jurkat細胞を固定化後、一般的なプロトコールで透過処理した。各染色体のセントロメアをストレプトアビジンHRP抱合体で検出し、iFluor 488 Styramide試薬を用いて可視化した。染色体はDAPIで対比染色した。

 

フローサイトメトリ

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図7 iF488標識ヤギ抗-ウサギIgG手法、チラミド手法、またはStyramide手法を用いたJurkat細胞におけるpAKTのフローサイトメトリ分析
Styramide増幅手法では、ヤギ抗-ウサギIgG-iFluor™488直接染色に比べてシグナルが10倍増大し、Alexa Fluor 488チラミド染色に比べてシグナルが5倍増大した。

 

プロトコール概要

PSA™画像処理では、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の触媒活性を使用して、in situにおいて標的タンパク質や核酸配列の高密度標識を行います。IHC、ICC、およびISHといった従来法の作業の流れと同様に、PSA™画像処理は2、3の単純な工程で構成されており簡単に実施できます。この作業の流れでは、蛍光二次抗体がポリ-HRP 二次抗体と置き換えられており、唯一の追加ステップとして標識Styramide™との培養が加わります。

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図8 Power Styramide™ Signal Amplification (PSA™) のプロトコール
作業の流れが従来型ICCやIHC手法のものに類似しているため、PSA™ キットや Styramide™試薬を用いることで、希望する標的を簡単なステップで高感度に検出できます。
1. 細胞または組織サンプルを固定化、透過処理、およびブロッキング。サンプルを無標識一次抗体、ビオチン化一次抗体、またはビオチン化核酸プローブと培養。
2. HRP-二次抗体またはHRP-ストレプトアビジン抱合体を添加。
3. iFluor™色素Styramide™作業溶液を添加し、HRPによりStyramide™を析出させる。
4. サンプルをマウントしシグナルを検出。

iFluor™ Styramide™試薬

品名 分子量 Ex(nm) Em(nm) フィルターセット 類似のスペクトルをもつ色素 品番
iFluor™ 350 Styramide™ 931.13 345 442 DAPI AMCA, Alexa Fluor® 350, DyLigh® 350 45000
iFluor™ 488 Styramide™ 1037.99 491 514 FITC FITC, DyLight 488®, Alexa Fluor® 488 45020
iFluor™ 546 Styramide™ 1326.69 541 557 Cy3/TRITC Alexa Fluor® 546 45025
iFluor™ 555 Styramide™ 1023.15 552 567 Cy3/TRITC Cy3®, DyLight® 550, Alexa Fluor® 555 45027
iFluor™ 568 Styramide™ 1243.60 568 587 Cy3/TRITC Alexa Fluor® 568 45030
iFluor™ 594 Styramide™ 1341.71 592 616 Cy3/TRITC Texas Red®, DyLight® 594, Alexa Fluor® 594 45035
iFluor™ 647 Styramide™ 1231.63 649 665 Cy5 Cy5®, DyLight® 650, Alexa Fluor® 647 45045
iFluor™ 680 Styramide™ 1151.28 676 695 Cy5 Cy5.5®, IRDye® 700, Alexa Fluor® 680 45050
iFluor™ 700 Styramide™ 1158.44 685 710 Cy7 Alexa Fluor® 700 45055
iFluor™ 750 Styramide™ 1257.67 749 795 Cy7 Cy7®, DyLight® 755, Alexa Fluor® 750 45065
iFluor™ 790 Styramide™ 1525.02 782 811 Cy7 IRDye® 800, Alexa Fluor® 790 45070
品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
iFluorTM 350 Styramide *Superior Replacement for Alexa Fluor 350 tyramide*詳細データ ABD 45000 100 SLIDE
¥65,000
iFluorTM 488 Styramide *Superior Replacement for Alexa Fluor 488 tyramide*詳細データ ABD 45020 100 SLIDE
¥65,000
iFluorTM 546 Styramide *Superior Replacement for Alexa Fluor 546 tyramide*詳細データ ABD 45025 100 SLIDE
¥65,000
iFluorTM 555 Styramide *Superior Replacement for Alexa Fluor 555 tyramide*詳細データ ABD 45027 100 SLIDE
¥65,000
iFluorTM 568 Styramide *Superior Replacement for Alexa Fluor 568 tyramide*詳細データ ABD 45030 100 SLIDE
¥65,000
iFluorTM 594 Styramide *Superior Replacement for Alexa Fluor 594 tyramide*詳細データ ABD 45035 100 SLIDE
¥65,000
iFluorTM 647 Styramide *Superior Replacement for Alexa Fluor 647 tyramide*詳細データ ABD 45045 100 SLIDE
¥65,000
iFluorTM 680 Styramide *Superior Replacement for Alexa Fluor 680 tyramide*詳細データ ABD 45050 100 SLIDE
¥65,000
iFluorTM 700 Styramide *Superior Replacement for Alexa Fluor 700 tyramide*詳細データ ABD 45055 100 SLIDE
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iFluorTM 750 Styramide *Superior Replacement for Alexa Fluor 750 tyramide*詳細データ ABD 45065 100 SLIDE
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iFluorTM 790 Styramide *Superior Replacement for Alexa Fluor 790 tyramide*詳細データ ABD 45070 100 SLIDE
¥65,000

iFluor™ PSA™ イメージングキット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
iFluor 350TM PSATM Imaging Kit with Goat Anti-Mouse IgG詳細データ ABD 45250 1 KIT
[100 Tests]
¥109,000
iFluor 350TM PSATM Imaging Kit with Goat Anti-Rabbit IgG詳細データ ABD 45200 1 KIT
[100 Tests]
¥109,000
iFluor 488TM PSATM Imaging Kit with Goat Anti-Mouse IgG詳細データ ABD 45260 1 KIT
[100 Tests]
¥109,000
iFluor 488TM PSATM Imaging Kit with Goat Anti-Rabbit IgG詳細データ ABD 45205 1 KIT
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iFluor 555TM PSATM Imaging Kit with Goat Anti-Mouse IgG詳細データ ABD 45270 1 KIT
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iFluor 555TM PSATM Imaging Kit with Goat Anti-Rabbit IgG詳細データ ABD 45220 1 KIT
[100 Tests]
¥109,000
iFluor 594TM PSATM Imaging Kit with Goat Anti-Mouse IgG詳細データ ABD 45280 1 KIT
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iFluor 594TM PSATM Imaging Kit with Goat Anti-Rabbit IgG詳細データ ABD 45230 1 KIT
[100 Tests]
¥109,000
iFluor 647TM PSATM Imaging Kit with Goat Anti-Rabbit IgG詳細データ ABD 45240 1 KIT
[100 Tests]
¥109,000
iFluor 647TM PSATM Imaging Kit with Goat Anti-Mouse IgG詳細データ ABD 45290 1 KIT
[100 Tests]
¥109,000

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¥43,000
AF594 tyramide reagent詳細データ ABD 11082 200 SLIDE
¥43,000
iFluorTM 488 tyramide詳細データ ABD 45100 200 SLIDE
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iFluorTM 555 Tyramide詳細データ ABD 45105 200 SLIDE
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iFluorTM 647 Tyramide詳細データ ABD 45110 200 SLIDE
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Biotin Styramide *Superior Replacement for Biotin Tyramide*詳細データ ABD 45300 100 SLIDE
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DIG Styramide *Superior Replacement for DIG tyramide*詳細データ ABD 45305 100 SLIDE
¥87,000
DNP Styramide *Superior Replacement for DNP tyramide*詳細データ ABD 45310 100 SLIDE
¥87,000

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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