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商品情報

研究用

チロシンキナーゼ阻害剤スクリーニングに最適なセルベースキナーゼアッセイPathHunter® Cell Based Kinase Assay
DiscoverX社;受容体型/細胞質型チロシンキナーゼのスクリーニング/プロファイリングに最適な安定発現細胞株

DiscoverX社;受容体型/細胞質型チロシンキナーゼのスクリーニング/プロファイリングに最適な安定発現細胞株" data-hatena-bookmark-layout="standard-balloon" data-hatena-bookmark-lang="ja" title="このエントリーをはてなブックマークに追加">このエントリーをはてなブックマークに追加

背景

哺乳動物では一般的に50種類以上の受容体型チロシンキナーゼが知られており、その受容体毎にリガンドが結合する細胞外ドメインの構造が異なります。一方、非受容体型チロシンキナーゼは、多くのサイトカイン受容体において観察され、多様な細胞内のシグナル伝達機構を構成しています。チロシンキナーゼファミリーは、細胞外からの増殖シグナルや分化シグナルを受容することによって活性化し、細胞内シグナル伝達分子へ情報を伝えるため、その機能異常は、癌の発症・進行を促す以外に、循環器疾患、糖尿病、自己免疫疾患等多様な疾患への関与が示唆されています。

チロシンキナーゼは、抗腫瘍薬のターゲットとしてその阻害剤の開発が脚光を浴びている一方で、副作用の低減や、特異性の向上を目的として、伝統的なキナーゼ阻害剤に加え、アロステリックモジュレーターや抗体医薬の新規開発も進んでいます。
DiscoverX社が提供するPathHunter® Cell Based Kinase Assayは、迅速かつ大規模なセルベースの阻害剤スクリーニング系の構築を可能とします。

特長

一般的な阻害剤のスクリーニングでは、精製キナーゼ等の生化学的手法による化合物と標的キナーゼの結合を評価しているため、生体内で活性を持つ化合物の探索は困難となります。キナーゼを発現させた細胞ベースのPathHunter®アッセイでは、薬効と細胞の反応をダイレクトに確認することにより、シグナリング経路に対する阻害作用の評価等、生物学的反応を確認することが可能となります。

  • Full Length, Human Receptor Protein: ヒト由来全長タンパク質を発現させることにより、同一評価系においてリガンド結合能、受容体の二量体化、キナーゼ活性をモニタリング可能
  • Ligand-Induced Functional Assay: 低分子キナーゼ阻害剤からブロッキング抗体などの高分子タンパク質、アロステリックモジュレーター、siRNAの同定が可能
  • No Wash, single addition Assay: 洗浄不要・ワンステップの簡便なアッセイ
  • Whole intact cell, HTS-friendly, Chemiluminescent assay: 化学発光に基づくHTS対応可能セルベースアッセイ、また薬物候補の細胞膜浸透性を同時に観察

 

PathHunter® Receptor Tyrosine Kinase Assays

PathHunter® Cytosolic Tyrosine Kinase Assays

PathHunter® Receptor Tyrosine Kinase Assays

受容体型チロシンキナーゼ(Receptor Tyrosine Kinase Assay)は、癌、代謝、免疫など様々な疾患に関与しています。精製したタンパク質ドメインや合成基質を用いた生化学的手法は、得られる生物学的情報に制限があるため、細胞学的情報を含むキナーゼの役割の解明が待たれます。
DiscoverX社が開発した本システムでは、全長タンパク質を発現した細胞株を用いておりますので、細胞内環境における受容体チロシンキナーゼのリン酸化状態をモニタリングできます。

PathHunter® Cell based Kinase Assay原理
Figure.1  PathHunter® Cell based Kinase Assay原理

原理

PathHunter®Cell Based Kinase Assayでは、C末端にProlink (PK)標識されている受容体型チロシンキナーゼ単量体と、SH2ドメインを持つアダプタープロテイン-Enzyme Acceptor(EA)融合タンパク質を、細胞内に強制発現させています。リガンド結合によって受容体の二量体化が起こり(homodimerization, heterodimerization)、続いて受容体がリン酸化されると、SH2ドメインを持つアダプタープロテインがリクルートされ、受容体シグナル伝達複合体(Receptor signaling complex)が形成されます。それに伴い、空間的に隣接したPKとEAの結合が促され、活性型β-ガラクトシダーゼが再構成されます。このβ-ガラクトシダーゼ活性による加水分解された基質の化学発光シグナルのレベルを測定することにより、受容体型チロシンキナーゼに対する化合物の作用を同定します。

適用

  • 一次、二次スクリーニングからのヒット化合物の探索
  • 低分子阻害剤、抗受容体抗体、抗リガンド抗体の探索
  • 抗体医薬品やアロステリックモジュレーターの作用機序の評価(figure.2)
  • 細胞表面の相互作用の探索
抗体医薬品やリガンド結合阻害評価データ

Figure.2抗体医薬品やリガンド結合阻害評価データ
A series of commercially available anti-receptor antibodies(Blocking antibodies) were tested with PathHunter® U2OS cells expressing Erb1  (93-0681C3) . A dose dependent inhibition can be observed.

(A)  PathHunter® U2OS cells expressing TrkA(93-0462C3) can also be used to profile anti-ligand antibodies. The data demonstrates agonist dose response and anti-ligand antibody’s inhibitory response.

(B)  PathHunter® TrkA, TrkB and TrkC cells can be sued to identify, screen or profile small molecue inhibitors.

ターゲットリスト

TARGET PRODUCT DESCRIPTION 細胞株 キット アダプター
プロテイン
RECEPTOR TYROSINE KINASE ASSAYS
AXL PathHunter® AXL Activity Assay   P85
C-KIT PathHunter® C-KIT Functional Assay P85
C-MET PathHunter® C-MET Functional Assay   GrB2
c-Ret-GFRα2 PathHunter® c-Ret-GFRα2 Functional Assay SHC1
DDR1 PathHunter® DDR1 Functional Assay SHC1
EphA4 PathHunter® EphA4 Functional Assay   PLCG2
EphA5 PathHunter® EphA5 Functional Assay PLCG1
EphA7 PathHunter® EphA7 Functional Assay PLCG1
EphB1 PathHunter® EphB1 Functional Assay SHC1
EphB2 PathHunter® EphB2 Functional Assay SHC1
EphB3 PathHunter® EphB3 Functional Assay SHC1
 EphB4  PathHunter® EphB4 Functional Assay SHC1
ErbB1 PathHunter® ErbB1 Functional Assay   PLCG1
ErbB2-ErbB3 PathHunter® ErbB2-ErbB3 Functional Assay GrB2
ErbB4 PathHunter® ErbB4 Functional Assay    SHC1
FGFR1 PathHunter® FGFR1 Functional Assay  PLCG2
FGFR1-β-Klotho PathHunter® FGFR1-β-Klotho Functional Assay    PLCG2
FGFR2 PathHunter® FGFR2 Activity Assay PLCG1
Flt3 PathHunter® Flt3 Functional Assay  P85
Flt4 PathHunter® Flt4 Functional Assay  GrB2
IGF1R PathHunter® IGF1R Functional Assay SHC1
INSR PathHunter® INSR Functional Assay  PLCG1
INSRb PathHunter® INSRb Functional Assay PLCG1
KDR PathHunter® KDR Activity Assay PLCG1
PDGFRa PathHunter® PDGFRa Functional Assay  PLCG1
PDGFRb PathHunter® PDGFRb Functional Assay  PLCG1
TrkA PathHunter® TrkA Functional Assay  SHC1
TrkA-P75 PathHunter® TrkA-P75Functional Assay  SHC1
TrkB PathHunter® TrkB Functional Assay  SHC1
TrkB-P75 PathHunter® TrkB-P75 Functional Assay  SHC1
TrkC PathHunter® TrkC Functional Assay  SHC1
TrkC-P75 PathHunter® TrkC-P75 Functional Assay  SHC1

B Available in Bulk Cell Only

細胞株及びキットは全て human となります。

*本細胞を用いたプロファイリングサービスも承っております。詳細はお問い合わせください。

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PathHunter® Cytosolic Tyrosine Kinase Assays

DiscoverX社のPathHunter®非受容体型チロシンキナーゼ(Cytosolic Receptor Kinase Assay)は、サイトカイン受容体や細胞質チロシンキナーゼに対するセルベースアッセイです。
サイトカイン受容体の多くは、受容体型チロシンキナーゼとは異なりキナーゼ活性を有しておらず、JAKなどの細胞内チロシンキナーゼと非共有結合で会合します。インターロイキンやプロラクチン、レプチン、エリスロポエチン、スロンボポエチン、G-CSFなどの受容体は、非受容体型チロシンキナーゼであるJAKによりリン酸化されます。これらのキナーゼは、自己免疫や癌に関わるいくつかのシグナル経路を介しているため、JAK阻害剤もしくは直接的な下流因子であるSTAT阻害剤は、創薬における新規ターゲットとして期待されています。

PathHunter(R) Cytosolic Tyrosine Kinase Assays 原理
Figure.3  PathHunter® Cytosolic Tyrosine Kinase Assays 原理

原理

細胞内ドメインにキナーゼ活性を有しないサイトカイン受容体は、細胞内に酵素を会合させることで、細胞内のシグナル伝達を開始します。シグナル伝達経路の最初のステップでは、リガンド誘導性受容体が多量体となり、受容体に会合している非受容体型チロシンキナーゼが受容体のリン酸化を誘導し、SH2領域を持つ下流シグナル分子がリクルートされます。PathHunter(R)細胞ベースアッセイでは、受容体の単量体にPKを標識、SH2ドメインを持つアダプタープロテインにEA融合体タンパク質を付加させ、また、非受容体型チロシンキナーゼを細胞に強制発現させています。

適用

  • サイトカイン受容体リン酸化の検出
  • JAK1,JAK2,JAK3の細胞内受容体キナーゼのモニタリング
  • リード化合物の評価や最適化
  • JAK阻害剤の同定

 

Cytosolic Receptor Kinase Assays 評価例

(A) Assays for Jak1 and Jak2 were developed using the G-CSFR-SHC1 PathHunter cell line. The G-CSFR is known to couple to both Jak1 and Jak2 kinases. Addtion of the agonist, G-CSF, induces the activation of the expressed kinase resulting in phosphorylation of the target receptor, binding of SHC1 and complementation of the enzyme that is measured using Pathhunter reagents.
(B)
CSF3R cell line was incubated with and inhibitors such as staurosporine, Lestaurtinib and Pyridone 6, P6, DBI(JAK Inhibitor 1) and challenged with EC90 of their respective agonists(G-CSR, a know agonist). A dose dependent inhibition was observed indicating that the assay can be used to screen or profile inhibitors against the JAK molecule.
(C)
The assay measures CSF3R activation, phosphorylation by JAK2 and interaction between CSF3R, JAK2 and SHC1 proteins in a cell-based assay.

Figure.4 Cytosolic Receptor Kinase Assays 評価例

ターゲットリスト

TARGET PRODUCT DESCRIPTION 細胞株 キット アダプター
プロテイン
CYTOSOLIC TYROSINE KINASE ASSAYS
BLK PathHunter® BLK Activity Assay PLCG1
CSF3R-JAK1 PathHunter® CSF3R-JAK1 Functional Assay SHC1
EpoR-JAK2 PathHunter® EpoR-JAK2 Functional Assay PLCG2
FGR PathHunter® FGR Activity Assay PLCG1
GHR-JAK1 PathHunter® GHR-JAK1 Functional Assay PLCG2
GHR-JAK2 PathHunter® GHR-JAK2 Functional Assay PLCG1
JAK3 PathHunter® JAK3 Activityl Assay PLCG1
PRLR-JAK1 PathHunter® PRLR-JAK1 Functional Assay PLCG2
PRLR-JAK2 PathHunter® PRLR-JAK2 Functional Assay PLCG2
SYK PathHunter® SYK Activity Assay PLCG1
TYK2 PathHunter® TYK2 Activity Assay PLCG1
YES1 PathHunter® YES1 Activity Assay PLCG1

細胞株及びキットは全て human となります。

*本細胞を用いたプロファイリングサービスも承っております。詳細はお問い合わせください。

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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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