タウ凝集体形成を細胞内で再現 タウ凝集アッセイキット

認知症は物忘れや認知機能の低下により日常生活に支障をきたす疾患で、神経細胞が脱落していくことにより進行します。認知症の6 割以上をアルツハイマー型認知症が占めていますが、未だに効果的な治療法は見つかっていません。アルツハイマー病は、老人斑と呼ばれるアミロイドβタンパク質の蓄積と、線維化したタウタンパク質の細胞内蓄積による神経原線維変化の出現により定義されています。線維化したタウタンパク質の蓄積は、前頭側頭型認知症（FTD）の原因の一つにもなっています。

タウタンパク質は神経細胞の軸索に局在して、軸索内の微小管の安定化に寄与しているということが知られています。非常に安定な構造をもつタンパク質であるのに、なぜ線維化してしまうのかということはよくわかっていませんが、プリオンタンパク質と同様に、線維化したタウタンパク質が線維化のための凝集核（シード）となり、正常構造のタウタンパク質を異常構造に変えることで凝集し線維化していくという説が有力だと考えられています。

本キットは、タウ凝集体形成を細胞内で再現するモデルであり、線維化タウのシードを細胞に導入することにより、細胞内のタウタンパク質の凝集を引き起こします。ヒトのタウタンパク質は6つのアイソフォームが存在することが知られています。本キットでは家族性タウオパチー変異であるP301L 変異を導入した最長のアイソフォーム（2N4R）とP301L 変異が入った線維化タウタンパク質シードとともに細胞に導入することで、タウ凝集体を細胞内に形成させます。

細胞内で線維化したタウタンパク質はリン酸化されるので、AT8などの代表的な抗リン酸化タウ抗体（S202/T205）によりリン酸化タウを確認することができます。また、アミロイド染色をすることにより、細胞内のタウ凝集を確認することが可能です。

※本製品は、長崎大学大学院医歯薬学総合研究科 松本弦先生より技術提供を、公益財団法人 東京都医学総合研究所より特許使用ライセンスを受けて製品化しております。

• P301L変異型タウ(2N4R)発現プラスミド（pCMV-Tau(2N4R)-P301L、緑キャップ）（内容量：50 μL、濃度：1 μg/μL）
• dGFP 発現プラスミドベクター（pCMV-dGFP、青キャップ）（内容量：5 μL、濃度：1 μg/μL）
• P301L変異型タウ線維化タンパク質（F-Tau(RD)-P301L、透明キャップ）（内容量：100 μL、濃度：1 μg/μL）

本製品のプラスミドベクターはATUM社で合成した商品を使用しています。

【別途ご準備いただくもの】

• アッセイ用細胞株（推奨 : Neuro 2a）
• 培養用培地（推奨 : DMEM、10%FBS）
• 遺伝子導入試薬（サーモフィッシャー : Lipofectamine® 3000 Transfection Reagent など）
• Opti-MEM®または無血清培地（サーモフィッシャー : 31985062等をご用意ください）
• 滅菌済み精製水

　サンプル
　　A: 未導入の細胞
　　B: pCMV-Tau(2N4R)-P301L プラスミドのみ導入した細胞
　　C: pCMV-Tau(2N4R)-P301L ＋ F-Tau(RD)-P301L両方を
　　　 導入した細胞
 
　検出抗体
　　①4R タウ抗体
　　　（コスモ・バイオ 品番：TIP-4RT-P01）
　　②ヒトPHF-TAU 抗体(AT8)
　　　（コスモ・バイオ 品番：90206）
SH-SY5Y 細胞（ヒト神経芽腫細胞) とTAU01 を用いたウェスタンブロットによるタウの検出
B レーンの結果から、4R タウは遺伝子導入でも検出され、タウタンパク質産生が確認可能。ただし遺伝子導入だけではリン酸化タウは検出されず、凝集体もできない。C レー ンで4R タウとリン酸化4R タウの両方を検出している。リン酸化タウ（AT8）が検出されるのは遺伝子と線維化たんぱく質を両方導入したときだけである。

ウエスタンブロットによる評価

図1：ウエスタンブロットによるリン酸化Tauの検出
本キットでTauを細胞内に凝集させた場合、リン酸化Tauの沈着が起こることが特長の一つ。
培養後の細胞をPBSで回収し、超音波破砕後に2％SDS sample bufferで溶解、100℃ボイル5分間の後、SDS-PAGE、ウェスタンブロットを常法にて行い、Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)（Thermofisher：MN1020）で検出した例。アミロイド染色をすることにより、細胞内のタウ凝集を確認することが可能です。
①pCMV-2N4R-P301Lプラスミドのみ導入した細胞
②pCMV-2N4R-P301L＋F-Tau(RD)-P301L　両方を導入した細胞

免疫染色による評価

図2：Tauを導入した細胞の免疫染色
pCMV-Tau(2N4R)-P301L＋F-Tau(RD)-P301L　両方を導入した細胞について、Anti-Tau Antibody, clone 2A1-2E1（MERCK：MABN2472-100UG）および-CellstainR- Hoechst 33342 solution（同仁化学研究所：H342）で検出した例。

図3：プラスミドマップ

※有償サンプル（品番：TAU03S）には限りがございます。
※有償サンプル（品番：TAU03S）に、1研究室あたりの購入個数制限はありません。

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