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記事ID : 17920

FAQ : Enzo Lifescience社 抗体作製キット FAQ

商品詳細:DiSH™ Kit

【01】 DiSH kit (品番ENZ-71001) を使った high specific clones はどれくらいで得られますか。

回収から最初のスクリーニングまで要する時間は14〜18日です。

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【02】 遺伝子操作された骨髄腫細胞の継代数に限界はありますか。

Sp2ab myeloma fusion partner は、薬物選択条件下 (0.5 mg/mL ゼオシン及び 0.25 mg/mL ジェネテシン) で60世代以上安定です。

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【03】 DiSH kitではどうやって high specific clones を単離するのですか。

DiSHは、遺伝的に操作した骨髄腫融合パートナーである Sp2ab を用いているため抗原特異的クローンの単離が可能です。Sp2ab と免疫した細胞から採取されたB細胞が融合すると、特異的免疫グロブリンの分泌と細胞表面の発現の両方を行うハイブリドーマになります。必要なハイブリドーマのみを同定マーカーで標識することで、標的抗原に結合する細胞をFACSまたは磁気分離により数千もの細胞プールから単離することができます。

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【04】 融合段階では、どれくらいの骨髄腫細胞とリンパ球が必要ですか。

リンパ球の数は、免疫したマウスから採集した細胞数により決定します。免疫した Balb/c からリンパ組織(脾臓、骨髄およびリンパ節)を採取すると、通常1 x 10^8リンパ球が回収できます。この値は、免疫応答、免疫に使用したマウス系統によって変わることもあります。5リンパ球に対して1骨髄腫細胞の比率で 50 mL WCM (洗浄培地:品番ENZ-70002) に添加することをお奨めします。この比率では最良の融合効率が得られています。

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【05】 「Antigen-specific sorting by flow」手順のステップ3で、細胞をRCMで30分間、氷上で培養する理由を教えて下さい。

このステップは染色過程での細胞の安定性を改善するためで、ソーティング後の生存率がよくなります。

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【06】 AbeoClone™ Medium はFACS実験に必要ですか。

シングルセルソーターが使えない場合、対象細胞をバルクソーティングするためにチューブに入れ、AbeoClone™Medium を使ってクローニングする必要があります。フローサイトメトリーを使って対象細胞 (標的抗原に結合する表面抗体を発現するハイブリドーマ)を単一細胞にまで選別することが可能であれば AbeoClone™ Mediumを用いた抗原陽性細胞の選別を行う必要はありません。

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【07】 「Antigen-specific selection by magnetic separation」手順の中で、Fc-Block試薬を使用する目的を教えて下さい。

Fc Block試薬は 抗体のFC領域を介したFc受容体を持つ細胞への非特異的結合を最小限にすることで標識バックグラウンドを減少させます。最適な結果が得られるよう、ハイブリドーマプロトコールの蛍光と磁気標識の両方において細胞をFc-Blockで培養することをお勧めします。

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【08】 磁気分離プロトコールを使った場合、AbeoClone™ Medium を使う必要がありますか。

はい。クローン性を得るためにAbeoClone™ Medium が必要です。AbeoClone™ Medium はハイブリドーマクローンの成長と単離に必要であり、セレクションやスクリーニング目的ではありません。対象細胞 (標的抗原に結合する表面抗体を発現するハイブリドーマ) のセレクションは、磁気細胞選別/分離 (MACS) または蛍光活性化選別 (FACS) により行われます。

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【09】 AbeoCloneTrade; Medium は ELISA での分泌抗体のスクリーニングに必要ですか。

必要です。AbeoClone™ Medium は対象細胞をクローン化するために用いる半固体培地です。AbeoClone™ Semisolid Medium でハイブリドーマクローンのコロニーを形成させ、単一コロニーを選択して液体培地の入った96穴プレートのウェルに入れます。液体培地中で数日間培養して細胞のクローン群が増殖し抗体を分泌した後、分泌抗体を含む培養上清をサンプルとしてELISAで抗原結合を分析します。

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