FAQ： Nordmark（NRD）社 Collagenase 製品および Neutral Protease 製品について

コラゲナーゼは、グラム陽性細菌 Clostridium histolyticum に由来するメタロプロテアーゼです。クロストリジウムコラゲナーゼには、コラゲナーゼ クラス I とコラゲナーゼ クラス II の 2 つのクラスがあります。これらは、それぞれの遺伝子colGおよびcolHの発現によって生成されます。
コラゲナーゼは、in situでヒトまたは動物の三重らせんコラーゲン分子のペプチド結合を切断します。2つのクラスは、コラーゲン分子に対する活性が異なります。コラゲナーゼ クラス I は、無傷なコラーゲンらせんをコラゲナーゼ クラス II の基質となる小さなペプチドに切断し、両方のクラスが相乗的にコラーゲンの効率的な分解に作用すると考えられています。すべてのCollagenase NB 製品には両方のコラゲナーゼ クラスが含まれています。

中性プロテアーゼとクロストリパインは、グラム陽性菌 Clostridium histolyticum に由来する酵素です。どちらも、主に組織解離のためにコラゲナーゼと組み合わせて使用されます。
中性プロテアーゼはメタロプロテアーゼであり、疎水性アミノ酸の前でさまざまなペプチドを切断し、それによってより小さなフラグメントを作成します。一方、Clostridiopeptidase B またはEndoproteinase Arg-C としても知られるクロストリパインは、アルギニンのカルボキシル側のペプチド結合を切断するプロテアーゼです。このタンパク質は、強力な非共有結合力によって重鎖と軽鎖で構成されているヘテロ二量体です。

Nordmark 社では、いくつかのCollagenase NB 製品およびNeutral Protease NB 製品を取り扱っており、それらは精製レベルや適用分野に応じて区別することができます。

• Collagenase NB 4 Standard Grade (品番 S1745401) とCollagenase NB 4G Proved Grade (品番 S1746501) には、タンパク質分解活性がバランスよく配合されています。 Collagenase NB 4G Proved Grade には、Collagenase NB 4 Standard Grade (≧ 0.10 PZ U/mg) と比較して、より高いコラゲナーゼ活性 (≧ 0.18 PZ U/mg) を持っています。それに応じて、タンパク質分解の副次的な活性も増加します。
• Collagenase NB 5 Sterile Grade は、ヨーロッパ薬局方 (Pharm. Eur) に従って滅菌されています。
  Collagenase NB 6 GMP Grade は、cGMP ガイドラインに従って製造されており、ヨーロッパ薬局方 (Pharm. Eur) に従って滅菌されています。
• Collagenase NB 7D Gentle Grade (品番 S1747401、品番 S1747402、品番 S1747403) は、コラゲナーゼ活性が≧ 0.2 U/mg の部分的に精製されたコラゲナーゼであり、天然ブレンド製品と Collagenase NB 8 Broad Range の中間に位置します。
• Collagenase NB 8 Broad Range (品番 S1745601) は、精製されたコラゲナーゼです。したがって、より高いコラゲナーゼ活性 (≧ 0.9 PZ U/mg) が含まれ、タンパク質分解の副次的な活性が減少します。
• Collagenase NB 1 Premium Grade (品番 S1745503) と Collagenase NB 1 GMP Grade (品番 N0002937) は、高精製コラゲナーゼです。これらは高いコラゲナーゼ活性 (≧ 3.0 PZ U/mg) を示し、副活性はほぼ完全に減少しています。これらの製品は同等の酵素活性を持っていますが、Collagenase NB 1 GMP Grade は、GMP ガイドラインに従って製造されています。
• アニマルフリーの製品である Collagenase AF-1 GMP Grade (品番 N0003554、N0003855) と Neutral Protease AF GMP Grade (品番 N0003553) は、Collagenase NB 1 GMP Grade と Neutral Protease NB GMP Grade の代替品として使用することが可能です。これらは、動物由来成分の混入を避け、規制プロセスを簡素化させることができます。
• Neutral Protease NB (品番 S3030111) と Neutral Protease NB GMP Grade (品番 N0002936) は、同等の酵素活性 (≧ 0.5 DMC U/mg) を持っています。Neutral Protease NB GMP Grade は、GMP ガイドラインに従って製造されています。
• Neutral Protease NB High Active Grade (品番 S3030202) は、精製されているため、より高い活性 (≧ 5.0 DMC U/mg) を持っていますが、GMP グレードとしては利用することができません。
• Clostripain NB (品番 S2020501) は、アルギニンのカルボキシル側のペプチド結合を切断する高精製された酵素です。クロストリパインは、酵素活性が異なる酸化型 (天然状態) と還元型 (活性化型) の 2 つの異なるフォームで存在します。

Nordmark 社の Collagenase NB、Neutral Protease NB、Clostripain NB 製品はすべて Clostridium histolyticum 由来です。

Collagenase NB 1 GMP Grade (品番 N0002937)、Collagenase NB 1 Premium Grade (品番 S1745503)、 Neutral Protease NB GMP Grade (品番 N0003553)、Neutral Protease NB (品番 S3030111)、Neutral Protease NB High Active Grade (品番 S3030202) は、凍結乾燥前に 0.2 µm フィルターにかけられていますが、無菌的に製造されていません。したがって、ヨーロッパ薬局方 (Pharm. Eur) に従い、それら商品は無菌ではありません。
Collagenase NB 1 GMP Grade と Neutral Protease NB GMP Grade については、微生物学的検査が行われています。クロストリジウム属菌の非存在、総好気性微生物数 (TAMC)、および総真菌数 (TYMC) の仕様と結果は、ロット固有の分析証明書に記載されています。
Nordmark 社の Collagenase NB 6 GMP Grade (品番 N0002779) と Collagenase NB 5 Sterile Grade (品番 N0002778) は、ヨーロッパ薬局方 (Pharm. Eur) に従って無菌です。
他のすべての Collagenase NB と Neutral Protease NB 製品は無菌ではありません。

Nordmark 社の Collagenase NB 6 GMP Grade と Collagenase NB 5 Sterile Grade は、ヨーロッパ薬局方 (Pharm. Eur) に従って無菌です。

Collagenase NB 1、Collagenase AF-1 GMP Grade、Neutral Protease NB、Neutral Protease AF GMP Grade は、ヒト膵臓からのランゲルハンス島の単離に特に適しています。これらの酵素のパックサイズは、当初、1 つのヒト膵臓の分解用に設計されました。
Collagenase AF-1 GMP Grade は、複数の追加アプリケーションで使用できるように、より小さいパックサイズ (≧ 150 PZ U) でもご購入可能です。
他の Collagenase NB 製品はさまざまな用途に適しているため、特別なパックサイズは必要ありません。

Nordmark 社の Collagenase NB、Neutral Protease NB、Clostripain NB 製品は、凍結乾燥粉末として提供されます。Collagenases と Neutral Proteases は、乾燥環境で 2 ~ 8 ℃ (分析証明書に別途記載がない場合) で保管する必要があり、Clostripain NB は −15 ℃ ~ −25 ℃ で保管する必要があります。 これらの条件下では、製品は分析証明書に記載されている有効期限まで安定です。バイアルを繰り返し開閉することは避けてください。 ストック溶液の保管についてはQ11をご参照ください。

Collagenase NB、Neutral Protease NB、Clostripain NB の安定性は、分析証明書に記載されている有効期限まで保証されます。一定の性能を保証するために、非 GMP グレードの製品は定期的に再試験され、その結果に応じて有効期限が延長される場合があります。
GMP グレード製品の安定性データについては、Q 29 を参照してください。

製品の有効期限を記載したロット固有の分析証明書は、すべての Collagenase NB、Neutral Protease NB、Clostripain NB に付属しています。
Collagenase NB 1 GMP Grade、Neutral Protease NB GMP Grade、Collagenase NB 6 GMP Grade の使用期限もバイアルのラベルに記載されています。
特定のロットの分析証明書をご希望の場合はお問い合わせください。

Nordmark 社では、酵素を適切な量の緩衝液（例えば HBSS、PBS、トリスまたはリンガー溶液）に溶解してストック溶液を作成することを推奨しています。再構成された酵素は、濾過滅菌（滅菌でない場合）し、小分けして、−20 ℃ で保存する必要があります。Nordmark 社の安定性研究では、凍結解凍の繰り返しを避けた場合、酵素はこれらの条件下で 1 年間安定であることが示されています。
バイアルを数回開閉すると、凍結乾燥状態の酵素が空気中の湿気と接触し、活性が低下する可能性があります。

はい、これらの溶液は 0.22 µm でフィルター処理できます。 タンパク質結合性の低いフィルター（酢酸セルロース、PVDF、PES など）の使用をお勧めします。

はい、これらの溶液は 0.22 µm でフィルター処理できます。 タンパク質結合性の低いフィルター（酢酸セルロース、PVDF、PES など）の使用をお勧めします。

Collagenase NB、Neutral Protease NB、Clostripain NB の活性は 37 °C で最適になります。

コラゲナーゼの活性は、pH 7.4 で最適になります。

Neutral Protease と Clostripains NB の活性は、中性付近の pH で最適になります。

酵素を空気中の湿気から保護することは、非常に重要です。コラゲナーゼと中性プロテアーゼは両方とも吸湿性です。したがって、バイアルを繰り返し開閉しないでください。
酵素が湿気と接触すると、自己分解により活性を失う可能性があります。
製品全体を一度に使用しない場合は、ストック溶液を調製し、−20 ℃ で保存することをお勧めします。詳しくはQ11を参照してください。

Collagenase NB 1 GMP Grade と Neutral Protease NB GMP Grade は、配送先に応じてクールパックまたはドライアイスで発送されます。Collagenase NB 1 GMP Grade は、25 ℃ で 2 か月間、40 ℃ で 7 日間安定です。Neutral Protease NB GMP Grade は、25 ℃ で 6 か月間、40 ℃ で 7 日間安定です。どちらの製品にも温度トレーサーが発送時付属されます。トレーサーは、酵素が 37 ℃ 以上の温度にさらされたかどうかを示します。
Clostripain NB は、温度インジケーター ストリップを含むドライアイスにて出荷されます。輸送中にストリップが高温を示した場合は、ご連絡ください。
Collagenase AF-1 GMP Grade と Neutral Protease AF GMP Grade は、安定性が高いため、常温で出荷されます。
Collagenase NB 6 GMP Grade は、室温で出荷されます。Collagenase NB 6 GMP Grade については、25 ℃ で 3 年間、40 ℃ で 4.8 か月間安定であることがデータによって示されています。
Nordmark 社の GMP 製品については、ICH ガイドラインに従った安定性研究が実施されました。詳しくは、Q 29 を参照してください。他のすべての Nordmark 社の Nordmark Collagenase NB と Neutral Protease NB 製品の安定性データなど、さらに詳しい情報が必要な場合は、お問い合わせください。

Nordmark 社の Collagenase NB 製品はコラーゲンを含むすべてのヒトまたは動物組織からの細胞単離に使用することができます。膵臓、脂肪組織、軟骨、肝臓、肺、胎盤、心臓など、その他多くの組織タイプで、生細胞の高収率を伴う、効率的な細胞単離が示される可能性があります。
コラゲナーゼは、Nordmark 社では、研究グレードと GMP グレードの両方のCollagenase NB 製品を提供しています。
Nordmark 社の Collagenase NB 製品は、さまざまな精製レベルの商品を扱っています。
Collagenase NB 4 Standard Grade、Collagenase NB 5 Sterile Grade、Collagenase NB 6 GMP Grade、Collagenase NB 4G Broad Range は、コラーゲン分解活性 と中性プロテアーゼや クロストリパインなどの 他のタンパク質分解活性がバランスよく混合されている未精製グレードです。これらの副次的な活性は、脂肪組織、軟骨、肝臓などの多くの組織タイプを効率的に分解するために必要です。
Collagenase 7D Gentle Grade は、上記製品よりもコラゲナーゼ活性が高いものの、精製品よりはコラゲナーゼ活性が低い、部分的に精製されたコラゲナーゼです。腫瘍細胞の分離など、複数の用途に使用できます。げっ歯類の膵臓からのランゲルハンス島の単離など、一部の用途では、より高いコラーゲン分解活性と低い副次的な活性を備えたコラゲナーゼが求められます。これらの用途には、精製された Collagenase NB 8 Broad Range が推奨されます。
ヒト膵島の単離用に、Nordmark 社は高精製された Collagenase AF-1 GMP Grade、 Neutral Protease AF GMP Grade、Collagenase NB 1、Neutral Protease NB を GMP グレードおよび非 GMP グレードとして提供しています。アニマルフリー酵素は、脂肪組織や腫瘍などの他の組織から細胞を単離するためにも使用されます。
アプリケーションの詳細については、www.nordmark-biochemicals.com をご覧いただくか、お問い合わせください。

効率的な組織解離にはタンパク質分解の副次活性が必要なため、Collagenase NB 1 は通常、Neutral Protease NB と組み合わせて使用されます。どちらの酵素も、ヒト膵臓のランゲルハンス島の単離に特に適しています。分離に必要な2 つの酵素の濃度は、例えば、 ドナーの年齢や、臓器の重量、状態によるため、2 つの酵素を別々に供給することで、これらの変数に応じた個別の投与が可能になります。

必要なコラゲナーゼ濃度は、組織の種類や由来、および分離手順によって異なります。したがって、細胞分離プロトコルに記載されているCollagenase NB の濃度を起点としていただき、分解時間やCollagenase NB の濃度を増減させご検討ください。最適な条件を決定するために、分解プロセスの進行を視覚的にモニタリングする必要があります。

PBS、Tris、HBSS などのいくつかの種類のバッファーがコラゲナーゼによる細胞分離に機能することがわかっているため、Nordmark 社では特定のバッファーを推奨することはしていません。コラゲナーゼはカルシウムに依存するため、≧ 2 mM Ca²⁺ を含むバッファーを使用することをお勧めします。コラゲナーゼは EDTA によって阻害されるため、バッファーにはカルシウムキレート剤 (EDTA など) を絶対に含めないでください (Q 24 を参照)。

消化の進行は、冷却、希釈、または消化溶液の洗浄によって抑えることができます。いくつかの方法が機能し、組織や細胞の種類、用途にも依存するため、一般的な推奨事項はありません。

コラゲナーゼおよび一部の二次プロテアーゼはカルシウムに依存するため、≧ 2 mM Ca²⁺を含むバッファーを使用することをお勧めします。カルシウムキレート剤 (EDTA など) は絶対に含めないでください。
コラゲナーゼは、高い pH 値では可逆的に不活性化され、低い pH 値では不可逆的に不活性化されます。コラゲナーゼの阻害剤には、システインや EDTA などのキレート剤が含まれます。

GMP は Good Manufacturing Practice の略です。good manufacturing practice とは、製品の品質を保証するのに役立つ製造および試験慣行のことです。多くの機関では、GMPガイドラインに従って医薬品や医療機器を製造することを求めています。これらのガイドラインには、材料のトレーサビリティ、製造、品質管理と保証、梱包、保管、流通などの要件が含まれています。

Nordmark 社の Collagenase NB と Neutral Protease NB 製品はすべて、ドイツの製薬会社 Nordmark Pharma GmbH によって製造されています。生産は、専用の生産施設で検証および校正された機器が使用されており、資格のあるスタッフによって行われています。これにより、製品の一貫した高品質と安全性が保証されます。Nordmark 社は、創傷治癒の最終医薬品の有効成分として使用されるコラゲナーゼも製造しています。ドイツ当局はNordmark 社に医薬品製造のライセンスを付与しました。また、ドイツ医薬品法 (Arzneimittelgesetz - AMG) の第 13 条第 1 項に従って、動物および微生物由来の有効成分の製造許可が付与されました。

Collagenase NB 6 GMP Grade (品番 N0002779) のテストおよびプロトコールの確立には、Collagenase NB 4 Standard Grade (品番 S1745401) の適用をお勧めします。この非 GMP グレードは、Collagenase NB 6 GMP Grade と同等の酵素特性を持ち、より安価でご提供しています。プロトコール確立後は、プロトコールの詳細を変更することなく、Collagenase NB 4 Standard Grade から Collagenase NB 6 GMP Grade に簡単に切り替えることができます。
Collagenase NB 1 Premium Grade (品番 S1745503) と Neutral Protease NB (品番 S3030111) からCollagenase NB 1 GMP Grade (品番 N0002937) と Neutral Protease NB GMP Grade (品番 N0003553)へ、もしくは Collagenase AF-1 GMP Grade (品番 N0003554) と Neutral Protease AF GMP Grade (品番 N0003553)への移行の場合も同様です。

はい、Nordmark 社の Collagenase NB と Neutral Protease NB は TSE safe とみなされます。
GMP 準拠のCollagenase NB およびNeutral Protease NB 製品について、原材料の安全性は、欧州医薬品品質部門（EDQM）による「伝達性海綿状脳症 - ヨーロッパ薬局方認証」 (TSE-CEP) によって証明されています。
ご要望に応じて、製造元 Nordmark 社からアクセスレターが発行されます。これにより、当局への提出に TSE-CEP 証明書を使用できるようになります。Nordmark 社が発行する TSE リスクステートメントも、GMP 製品のお客様へご提供しています。
non-GMP grade Collagenase NB と Neutral Protease NB 製品は、ご要望に応じて、Nordmark 社から原産地証明書 (Certificate of Origin) を入手することができます。原産地証明書には、製品に特定のリスク物質が含まれておらず、また製品が特定のリスク物質に由来しないことが記載されています。

Collagenase NB 1 GMP Grade と Neutral Protease NB GMP Grade、Collagenase NB 6 GMP Grade については、ICH ガイドラインに従った安定性研究が製造元 Nordmark 社 によって実施されています。GMP 製品のお客様は、ご要望に応じて、これら研究の概要レポートを入手することができます。凍結乾燥物の安定性研究は、以下の条件で実施されています。

Collagenase NB 1 GMP Grade と Collagenase NB 6 GMP Grade、Neutral Protease NB GMP Grade のお客様は、ご要望に応じて以下の文書をご利用いただくことが可能です。

• 分析証明書
• Nordmark 社のGMP証明書
• コラゲナーゼの製造許可証
• EDQM の TSE 安全性証明書 (TSE-CEP)
• ウイルス安全性研究の概要
• 安定性概要レポート

コラゲナーゼメーカー各社は、独自の製造および精製プロセスを持っているため、異なるサプライヤーのコラゲナーゼ製品を比較することは困難です。さらに、サプライヤーはコラゲナーゼ活性をさまざまな単位で記載しています。選択肢の一つとしては、用途に応じて適切な Nordmark 社の Collagenase NB 製品を選択することです。推奨製品やアプリケーションデータについては、Nordmark 社ホームページをご覧いただくか、お問い合わせください。別の選択肢としては、以前に使用されたコラゲナーゼの活性単位を PZ 単位に変換することです (Q 33 を参照)。

Nordmark 社の Collagenase NB 製品は、Wuensch に従って PZ 単位で記載されています。1 PZ U は、25 ℃、pH 7.1 で 1 分あたり 1 µmol の 4-phenylazobenzyl- oxycarbonyl-L-prolyl-L-leucyl-glycyl-L-prolyl-D-arginine (PZ) の加水分解を触媒します。 (Wünsch, E. & Heidrich, H.G. (1963) Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 333, 149-51).

コラゲナーゼ活性は通常、PZ 単位 (Wuensch による)、コラーゲン消化単位 (CDU、Mandl 単位としても知られている)、または FALGPA 単位で表されます。 正確な変換係数はありませんが、次のおおよその変換係数を適用することができます。 1 PZ U ~ 3.9 FALGPA U
1 PZ U ~ 1000 Mandl U または CDU

さらに、サプライヤーはさまざまな精製レベルのコラゲナーゼを提供しているため、異なるサプライヤーのコラゲナーゼを比較することはさらに困難です。用途に応じて、適切な Collagenase NB 製品と濃度を選択してください。推奨製品やアプリケーションデータについては、Nordmark 社ホームページをご覧いただくか、お問い合わせください。

1 DMC 単位は、25 ℃、pH 7.0 で 1 分あたり 1 µmol のジメチルカゼイン(DMC)のペプチド結合の切断を触媒します。これは、新しく形成されたアミノ基末端として表され、TNBS で測定されます。
(Lin, Y.-C. et al. (1969) J. Biol. Chem. 244, 789-93).

いいえ、Nordmark 社の Collagenase NB と Neutral Protease NB 製品は、マイコプラズマについてテストされていません。しかしながら、Collagenase NB の発酵プロセスで使用されるすべての培地は、製造前にオートクレーブ処理され、プロセス中に存在する可能性のあるすべてのマイコプラズマが不活性化されます。

エンドトキシンは、グラム陰性菌の外膜の主要成分であるリポ多糖です。現在、以下の製品はエンドトキシンについてテストされています。

• Collagenase AF-1 GMP Grade (品番 N0003855, N0003554)
• Collagenase NB 1 GMP Grade (品番 N0002937)
• Collagenase NB 1 Premium Grade (品番 S1745503)
• Collagenase NB 6 GMP Grade (品番 N0002779)
• Collagenase NB 8 Broad Range (品番 S1745601)
• Neutral Protease AF GMP Grade (品番 N0003553)
• Neutral Protease NB GMP Grade (品番 N0003553)
• Neutral Protease NB High Active Grade (品番 S3030202)

分析証明書は、すべてのCollagenase NB と Neutral Protease NB の出荷時に提供されるロット固有の文書です。分析証明書には、コラゲナーゼ活性や保存期限などのロット固有のデータが記載されています。Nordmark 社 製品の CoA はこちら からご参照ください。またGMP グレードの分析証明書については、お問い合わせください。

Nordmark 社の Collagenase NB と Neutral Protease NB 製品は、注射や軟膏など、ヒトへ直接使用することを目的としていません。