FAQ：Echelon Biosciences（ECL）社

[A1]これらの製品で細胞溶解物を使用することはお勧めできません。これは、バックグラウンドが高くなり、他の細胞成分やタンパク質の非特異的結合により陽性シグナルが不明瞭になる可能性があるためです。

[A2]シグナルが完全に存在しない (白い膜) 状態は通常、結合タンパク質の活性の損失、またはアッセイバッファー中の界面活性剤濃度の高さが原因です。いずれの場合も、問題を特定するために、対象の脂質のポジティブコントロールを用いて確認することをお勧めします。異常な結合が観察された場合、界面活性剤が強い、または検出試薬使用後の膜の過剰な添加が原因である可能性があります。

[A3]すべてのストリップとアレイは、HRP 結合二次抗体を使用して内部検証されており、沈殿試薬または化学発光溶液とともに使用できます。これらの製品では蛍光結合二次抗体の使用も可能ですが、バックグラウンドシグナルを低減するために抗体濃度を最適化することをお勧めします。

バックグラウンドが高い原因は、ウォッシュが不十分であるか、最初のインキュベーションステップで使用された結合タンパク質が過剰量であることが可能性が高いです。バックグラウンドシグナルは、ブロッキングバッファの構成を調整することによっても低減することができます。

[A1]PIPn抽出プロトコルは、NIH-3T3マウス線維芽細胞、MDA-MB-231 ヒト乳がん、MDA-MB-468 PTEN 欠損ヒト乳がん、 HL-60細胞で検証されております。

[A2]細胞数をカウントする、または細胞タンパク質アッセイを実施することにより、細胞を正規化できます。接着細胞は、刺激前または細胞抽出の前にカウントします。非接着細胞は、刺激前または細胞抽出の前にカウントします。
刺激後、細胞をスピンダウンし、培地をデカンテーションし、氷冷した0.5 M TCAを加え、細胞抽出プロトコールに進みます。細胞抽出に使用するフラスコと同じ細胞希釈液を使用した別のフラスコで、細胞数をカウントするか、タンパク質アッセイを行ってください。
注意点として、0.5MのTCAを添加した後に、血球計数器またはプロテインアッセイで細胞をカウントすることは推奨できません。また、0.5 M TCAを添加する前に細胞をトリプシン処理しないでください。 最適な細胞数は、アッセイするPIPnによって異なります。

[A3]はい、通常、タンパク質、中性脂質、酸性脂質の除去には連続抽出プロトコルをお勧めします。

[A4]定量に必要な細胞数は、細胞の種類および PIPn ごとに条件検討する必要があります。推奨される開始量は製品固有のデータシートに記載されています。より多い/より少ない量の細胞が必要な場合は、抽出量に比例して調整する必要があります。

[A5]一般に、キットに記載されている抽出プロトコルは組織でも同様に機能します。組織の破片や不溶性物質を除去するために、デタージェントバッファーを使用して組織をホモジナイズする必要があります。得られたライセート上清を脂質抽出に使用します。

[A1]アッセイの選択は主に3つの要素によって決まります。
1. PI3K 酵素のクラス
2. 感度
3. サンプルの種類
ECL社が利用可能な PI3K アッセイの比較ガイドは、こちらでご覧いただけます。

[A2]一般に、PI3K 活性の分析には、精製酵素または免疫沈降サンプルが必要です。ただし、当社の PI3-キナーゼ活性 ELISA: Pico (カタログ番号 K-1000s) は細胞溶解物も使用でき、このサンプルタイプのプロトコルが含まれています。

[A3]いいえ、ECL社の利用可能なすべての PI3K アッセイには放射性物質は不要で、吸光度または蛍光測定に基づいています。

[A1]ECL社の脂質抗体は、タンパク質抗体に使用される方法とほぼ同様の方法で作製されます。合成脂質はキャリア分子に結合され、その結合体を宿主動物において免疫応答させるために使用します。次に、免疫応答で生産された細胞を使用してハイブリドーマが生成され、その後、モノクローナル性と特異性を確保するために選択とスクリーニングが行われます。

[A2]検証済みのアッセイは抗体によって異なります。ECL社内で検証されたアッセイは、製品ページまたは技術データシートの「アプリケーション」セクションにあります。科学雑誌に発表されているが、ECL社によって独自に検証されていないアッセイは、特定の抗体の参考文献リストで見つけることができます。

[A3]はい、immunocytochemistryおよびimmunohistochemistryの一般的な手法を脂質抗体に適用できます。ただし、免疫染色プロトコルが目的の脂質の検出にどのような影響を与えるかを最初に検討することをお勧めします。一連の推奨プロトコルとその他の考慮事項については、ここを参照してください。

[A1]ECL社では、NIH-3T3、3T3-L1、初代心臓線維芽細胞 (ラットおよびマウス）、HeLa、MDCK、HL-60、BMMC (骨髄由来マスト細胞)、 A. thaliana root-tip細胞、 E.coli、および原生生物のC.parvumへの蛍光ホスホイノシチドの送達に成功しました。。他のセルタイプについては、お客様ご自身で検証いただく必要がございます。

[A2]ビスリン酸化 PIP または PIP3 の場合は、まずヒストン H1 (キャリア 2)をお勧めします。モノリン酸化 PIP を送達しようとしている場合は、キャリア 3 をお勧めします。