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Q&A

記事ID : 45458

CRISPR Cas9 ヌクレアーゼについて

【商品詳細】

【01】CRISPR Cas9 はどのように機能しますか。

CRISPR Cas9システムでは、sgRNA(シングルガイドRNA)に誘導されたCas9ヌクレアーゼが、protospacer adjacent motif(PAM)、すなわちNGGを含むDNAの3bp上流で標的二本鎖切断を直接行い、部位特異的DNA二本鎖切断(DSB)を形成します。これらのDSBは、塩基のランダムな挿入や欠失を起こす非相同末端接合(NHEJ)や、切断部位を修復するための相同組換え修復(HR)のような、細胞固有の修復機構によって修復されます。

【02】研究グレードの Cas9 ヌクレアーゼと GMP グレードの Cas9 ヌクレアーゼの主な違いは何ですか。

  1. 製造環境: GMP グレードの Cas9 は、高基準の GMP 認定製造施設で製造されています。研究グレードの Cas9 は、標準的な製造施設で製造されます。
  2. 品質管理: GMP グレードの品質管理テストは、研究グレードよりも包括的です。KACTUS社の GMP グレード Cas9 は、発売前に 14 種の品質管理テストを受けています。
  3. ドキュメントのサポート: GMP グレード Cas9 には、データシート、TSE/BSE ステートメント、COA、COO、MSDS、DMF、メラミン ステートメント、ニトロソアミン ステートメントなどのカスタマイズ可能なドキュメント パッケージが含まれています。バッチ生産記録やバッチ検査記録も提供できます。

【03】KACTUS社のCas9の活性はどのように確認されていますか。

KACTUS社では、in vitro 切断活性と ex vivo ノックアウト効率という 2 種類の活性アッセイを使用して活性を分析します。KACTUS社の in vitro 切断活性アッセイは、形成された 2 つの切断フラグメントの合計質量比を検出することによって Cas9 の切断活性を評価するもので、品質管理用のリリースアッセイです。ex vivo 遺伝子ノックアウト効率は、293T 細胞、Jurkat 細胞、および T 細胞で検証しております。ただし、すべての Cas9 バッチの遺伝子ノックアウト効率を検証しているわけではありません。

【04】KACTUS社のCas9のノックアウト効率は?

293T細胞、Jurkat細胞、プライマリーT細胞において、KACTUS Cas9の遺伝子ノックアウト効率を主要サプライヤーと比較して分析しました。KACTUS社のGMP Cas9は非常に高い遺伝子ノックアウト効率を示し、主要サプライヤーと同等でした。
とはいえ、ノックアウト効率は、細胞のタイプ、標的配列、Cas9とsgRNAのモル比、Cas9とsgRNAの濃度、エレクトロポレーターのタイプ、エレクトロポレーションパラメーター、およびその他の要因に依存するため、お客様のプロジェクトに基づき、様々な条件で酵素をテストすることを強くお勧めします。

【05】Cas9 の推奨使用量はどれくらいですか。

使用する Cas9 の量は、エレクトロポレーションシステムのサイズ、エレクトロポレーターの種類、エレクトロポレーション条件、細胞の種類、sgRNAターゲティング サイトなどの要因によって変動します。たとえば、2×105 細胞から 1×106 細胞の場合、1- 4µM(25µLエレクトロトランスファーシステム中)で濃度をタイトレーションし、濃度条件検討を行います。

【06】KACTUS Cas9 10mg/mL は何mol/Lですか。

モル濃度 (M) = 質量濃度 (C) / 分子量 (Mr) = 10mg/mL / 163000 g/mol = 61.35µM

【07】Cas9 の希釈にはどのようなバッファーがお勧めですか。

Cas9 濃度は 10mg/mL で、希釈しての使用はお勧めしません。ただし、必要な場合には、グリセロールを含まない保存用バッファーを使用することをお勧めします。希釈後にCas9 を長期間保存する必要がある場合は、希釈保存用バッファーを使用することをお勧めします。希釈保存用バッファーは、30mM Tris pH 7.4、300mM NaCl、50% グリセロール、0.1mM EDTA です。希釈にはここからグリセロールを除いたバッファーをご用意ください。

【08】KACTUS Cas9 の配送および保管条件を教えてください。

CRISPR Cas9 はドライアイスとともに出荷されます。-20±5°C での保存をお勧めします。

【09】Cas9 (CRISPR Associated Protein 9) ELISA キットを使用して、他社の Cas9 残基を検出できますか?

お勧めできません。KACTUS社の Cas9 (CRISPR Associated Protein 9) ELISA キットは、KACTUS Cas9 の検出用に設計されており、KACTUS Cas9 を正確に定量できます。 Cas9 の他のサプライヤー商品は、プロトコルや製造プロセスに違いがある可能性があり、それがテスト結果を歪める可能性があります。

【10】Cas9 (CRISPR Associated Protein 9) ELISA Kitで得られたOD値が全体的に低かった場合、どのような理由が考えられますか。

  1. 試薬の添加がプロトコールに従っていない。
  2. インキュベーション時間と温度がプロトコールに従っていない。
  3. 波長の選択ミス。OD450 の値をご確認ください。
  4. キットの保管が適切でない。試薬には-20℃で保存するものと2〜8℃で保存するものがありますのでご注意ください。詳細は試薬または関連文書をご確認ください。

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