FAQ : KactusBio（KCT）社　CRISPR Cas9 ヌクレアーゼについて

CRISPR Cas9システムでは、sgRNA（シングルガイドRNA）に誘導されたCas9ヌクレアーゼが、protospacer adjacent motif（PAM）、すなわちNGGを含むDNAの3bp上流で標的二本鎖切断を直接行い、部位特異的DNA二本鎖切断（DSB）を形成します。これらのDSBは、塩基のランダムな挿入や欠失を起こす非相同末端接合（NHEJ）や、切断部位を修復するための相同組換え修復（HR）のような、細胞固有の修復機構によって修復されます。

1. 製造環境: GMP グレードの Cas9 は、高基準の GMP 認定製造施設で製造されています。研究グレードの Cas9 は、標準的な製造施設で製造されます。
2. 品質管理: GMP グレードの品質管理テストは、研究グレードよりも包括的です。KACTUS社の GMP グレード Cas9 は、発売前に 14 種の品質管理テストを受けています。
3. ドキュメントのサポート: GMP グレード Cas9 には、データシート、TSE/BSE ステートメント、COA、COO、MSDS、DMF、メラミン ステートメント、ニトロソアミン ステートメントなどのカスタマイズ可能なドキュメント パッケージが含まれています。バッチ生産記録やバッチ検査記録も提供できます。

KACTUS社では、in vitro 切断活性と ex vivo ノックアウト効率という 2 種類の活性アッセイを使用して活性を分析します。KACTUS社の in vitro 切断活性アッセイは、形成された 2 つの切断フラグメントの合計質量比を検出することによって Cas9 の切断活性を評価するもので、品質管理用のリリースアッセイです。ex vivo 遺伝子ノックアウト効率は、293T 細胞、Jurkat 細胞、および T 細胞で検証しております。ただし、すべての Cas9 バッチの遺伝子ノックアウト効率を検証しているわけではありません。

293T細胞、Jurkat細胞、プライマリーT細胞において、KACTUS Cas9の遺伝子ノックアウト効率を主要サプライヤーと比較して分析しました。KACTUS社のGMP Cas9は非常に高い遺伝子ノックアウト効率を示し、主要サプライヤーと同等でした。
とはいえ、ノックアウト効率は、細胞のタイプ、標的配列、Cas9とsgRNAのモル比、Cas9とsgRNAの濃度、エレクトロポレーターのタイプ、エレクトロポレーションパラメーター、およびその他の要因に依存するため、お客様のプロジェクトに基づき、様々な条件で酵素をテストすることを強くお勧めします。

使用する Cas9 の量は、エレクトロポレーションシステムのサイズ、エレクトロポレーターの種類、エレクトロポレーション条件、細胞の種類、sgRNAターゲティング サイトなどの要因によって変動します。たとえば、2×10⁵ 細胞から 1×10⁶ 細胞の場合、1- 4µM（25µLエレクトロトランスファーシステム中）で濃度をタイトレーションし、濃度条件検討を行います。

モル濃度 (M) = 質量濃度 (C) / 分子量 (Mr) = 10mg/mL / 163000 g/mol = 61.35µM

Cas9 濃度は 10mg/mL で、希釈しての使用はお勧めしません。ただし、必要な場合には、グリセロールを含まない保存用バッファーを使用することをお勧めします。希釈後にCas9 を長期間保存する必要がある場合は、希釈保存用バッファーを使用することをお勧めします。希釈保存用バッファーは、30mM Tris pH 7.4、300mM NaCl、50% グリセロール、0.1mM EDTA です。希釈にはここからグリセロールを除いたバッファーをご用意ください。

CRISPR Cas9 はドライアイスとともに出荷されます。-20±5°C での保存をお勧めします。

お勧めできません。KACTUS社の Cas9 (CRISPR Associated Protein 9) ELISA キットは、KACTUS Cas9 の検出用に設計されており、KACTUS Cas9 を正確に定量できます。 Cas9 の他のサプライヤー商品は、プロトコルや製造プロセスに違いがある可能性があり、それがテスト結果を歪める可能性があります。

1. 試薬の添加がプロトコールに従っていない。
2. インキュベーション時間と温度がプロトコールに従っていない。
3. 波長の選択ミス。OD₄₅₀ の値をご確認ください。
4. キットの保管が適切でない。試薬には-20℃で保存するものと2〜8℃で保存するものがありますのでご注意ください。詳細は試薬または関連文書をご確認ください。