FAQ : Mabtech（MAB）社 FluoroSpot について

私たちが最も遭遇する一般的な問題のひとつは、蛍光のバックグラウンドが高いことです。これが発生する理由はいくつかあります。

お客様から寄せられるもう一つの一般的な問題は、FluoroSpotウェルの中心が光ることです。FluoroSpotアッセイを行った後、私たちは誰でもできるだけ早くデータ解析に取りかかりたいと思うものです。焦りから、濡れているため光をあてると中心が光るプレートを読んでしまうことがよくあります。しかし心配はいりません！
プレートを暗所で完全に乾かしてから、再度読み取ればよいのです。

FluoroSpotでよく見られるもう一つのエラーは、ウェル内のスポット分布が不均一で、リング状や三日月状になることです。これはほとんどの場合、細胞をFluoroSpotウェルに添加した後に、別の試薬を添加したことによるものです。この添加は、プレート内の細胞を端に「押しやり」、そこに定着させます。ウェルの端付近の細胞濃度が高くなると、スポットがコンフルエントになり、スポットカウントに悪影響を及ぼします。さらにもう一つ、同様の問題として、インキュベーター内でプレートが平らに置かれず、細胞が片側に溜まることがあります。ここでの解決策は極めて簡単です。細胞を常に最後にウェルに加えるか、プレートに加える前に細胞を刺激剤と混ぜることです。後者のオプションを選択する場合は、バックグラウンドシグナルが高くなる可能性のある分析物の蓄積を避けるため、混合物を素早くFluoroSpotプレートに移すようにしてください。

異なる特異性を持つキャプチャー抗体を一緒にコーティングすると、あるサイトカインの捕捉が他のサイトカインの分泌に影響を及ぼすことがあります。この現象は一般にキャプチャー効果またはサイトカイン吸収効果と呼ばれます。キャプチャー効果により、スポットが非常に少なくなったり、全くスポットされなくなったりすることがあります。例えば、IL-2キャプチャー抗体は、分泌されたIL-2を捕捉することにより、下流のIL-2依存性サイトカイン分泌に必要なIL-2の量を減少させるため、T細胞の活性化を低下させる可能性があります。幸いなことに、キャプチャー効果は抗CD2 mAbを追加することでしばしば打ち消すことができ、T細胞に共刺激シグナルを与えてサイトカイン分泌を回復させることができます。

FluoroSpot リーダーでプレートを読み取った後、ウェルにスポットが見当たりません。何が起こったのでしょうか？FluoroSpot のウェルにスポットが現れない原因はいくつか考えられますが、最も一般的な問題とその解決法を表にまとめました：

FluoroSpot Flexキットでは、お客様独自の FluoroSpotの組み合わせをカスタマイズすることができます。これはつまり、IPFLプレートを自分でコーティングすることを意味します。各ウェルの底にあるPVDF膜は、エタノールで前処理した後、必要な量のキャプチャー抗体しか結合できず、膜は親水性になります。新しく調製した35％エタノール溶液を使用して、60秒以内に膜を活性化させます。

2つ目の問題は、ウェル内のエタノールのコーティングにムラがあることです。これは通常、キャプチャー抗体がメンブレンに結合できないために起こる "泡状 "の外観につながります。簡単な解決法は、エタノールを加えた後にプレートの側面を軽く叩き、メンブレン表面に均一に行き渡るようにすることです。

プレートを自分でコーティングしたくないですか？その場合は、IPFLプレートにキャプチャー抗体をプレコートしたFluoroSpot Plus、Pathキットをご覧ください。

FluoroSpotウェルのアーチファクトは珍しいことではありません。小さなほこりや髪の毛がメンブレンに付着し、ウェルのアーチファクトにつながることがあります。これらはマスキングツールで簡単に取り除くことができますが、最初からこれらを避けるように努力するのがベストです。いくつかヒントを紹介します：

• 0.2 µmの滅菌フィルターで試薬をろ過することで、ほこりや凝集物を除去し、より清潔なウェルを得ることができる。
• 最後のデカントステップでは、別の種類のペーパータオルやガーゼを使うと、プレートに付着する糸くずや埃の量を減らすことができる。
• 自動洗浄機は、粒子や埃が洗浄試薬に混入するリスクを低減し、アーチファクトの数を減らすのにも役立つ。

自己蛍光による問題を避けるため、ミリポア社ではFluoroSpot プレート用に特別なプレート（低- 蛍光 PVDF膜）を開発しています。膜は異なりますが、このプレートもMSIPS45 プレートと同じように最適なパフォーマンスを得るためにエタノールによる活性化を必要とします。

FluoroSpot 分析は、複数のコートされた抗体による生物学的に可能な捕捉効果を考慮に入れなくてはなりません。例えばIL-2 キャプチャー抗体の存在がT 細胞による活性化を減少させる可能性があります。IL-2 抗体による減衰効果を避けるために、Anti-CD28 抗体は、T 細胞がCD28 に結合することによる抗原特異的な応答に共刺激シグナルを供給するために添加することができます。Anti-CD28 抗体の共刺激は、Anti-CD28 抗体を添加または添加なしで培養された細胞の比較により評価することができます。

プレートは乾燥させ、暗所に保管して下さい。蛍光は、とても安定で数ヶ月保管することができます。しかし、より良い結果を得るためには、アッセイ後1 週間以内にプレートを解析することをお奨めします。新しくFluoroSpot システムでテストする際、いくつかのウェルを使用しFluoroSpotリーダーの適切なセッティングが必要になります。ウェル中のスポットは、繰り返し暴露された後で消えてしまいますので、いくつか余分なウェルを準備して下さい。

FluoroSpot は、目で観察することのできない蛍光スポットを可視化する必要があります。マブテック社ではFITC とCy3 のフィルターを備えた自動化リーダーの使用を推奨しています。2 つのアナライトを分析し、正しい測定結果を得るため、リーダーはオーバーレイ分析ができる機能を必要とします。AID のFluoroSpot リーダーはこの基準を満たしており、ELISpot 解析にも使用できます。

FluoroSpot アッセイは、細胞の表現型に関係なく細胞分泌物を検出するので、答えはNO です。しかし、分析の前に、細胞のソーティングなどを行っている場合には、分泌細胞の表現型に関する間接的情報が得られるかもしれません。