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記事ID : 36538

Biotium社 PCRによるDNAプローブラベリングプロトコル


必要な試薬

*dUTPコンジュゲートを用いた標識の場合は、PfuやVent®などの古細菌由来のpolymerasesを阻害するTaq DNA polymeraseをご利用ください。

ワークフロー

プロトコール

1.標識反応の準備

1.1 各標識反応に用いるPCR reaction mixを以下の表に従い準備します。

試薬 必要量/1反応 終濃度*
10X Taq reaction buffer 2 µL 1X
25 mM MgCl2 2 µL 5 mM
1 mM dATP 2 µL 100 µM
1 mM dCTP 2 µL 100 µM
1 mM dGTP 2 µL 100 µM
1 mM dTTP 1 µL 50 µM
10 µM forward primer 1 µL 500 nM
10 µM reverse primer 1 µL 500 nM
Template DNA 1 ng 50 pg/µL
Taq 1 U 0.05 U/µL
Molecular grade dH20 to 19 µL total -

*CF® dye dUTP添加後の濃度

1.2 1µL の 1 mM CF® dye dUTP を反応液に加えます。

  • オプション:非標識コントロールの反応の場合には、CF® dye dUTPの代わりに 1 µLの 1 mM dTTPを加えます。
  • 蛍光dCTPを使用する場合には、 50 µM dCTP、100 µM dTTPで反応液を調製し、さらに 1 µL の 1 mM CF® Dye dCTPを加えます。

2.PCR増幅

以下のプロトコルに従い、サーマルサイクラーを用いてPCR増幅を行います。

ステップ サイクル数
変性/Taq 活性化 94℃、 2 分*1 ホールド
変性 94℃、30秒
30 サイクル
アニーリング 30秒*2
伸長反応 72℃、1分*3
最終伸長反応 72℃、 5分 ホールド

*1: 本プロトコルはCheetah™ HotStart Taq DNA Polymerase用に最適化したものです。その他のホットスタート Taq ポリメラーゼをご利用の際には、より長い活性時間を要する場合があります。
*2: アニーリング温度は、お客様のプライマーの融解温度(Tm値)よりも5℃低く設定してください。
*3: 本プロトコルの設定は、200〜300 bpの増幅に適してしています。それ以上の長さの増幅を行う際には、伸長反応時間を長くする必要があります。

3.取り込まれていないヌクレオチドの除去

取り込まれていないヌクレオチドは、PCR clean-up キットもしくはG50 Sephadex® microspinを用いて除去します。

  • ハイブリダイゼーション前に除去する必要はありませんが、フリーの標識ヌクレオチドの蛍光により、アガロース電気泳動で標識PCR産物を評価することが難しくなることがあります。

4.アガロース電気泳動での標識評価

4.1 標識産物の10%を、DNAラダーと共にアガロースに添加し、泳動します。キャスティングする前に、DNA蛍光色素をアガロースに加えないようご注意ください。電気泳動後、標識プローブCF® 色素の蛍光をUVゲルトランスイルミネーターもしくは最適波長のレーザーゲルスキャナーを用いて観察します。

  • 1つのレーンには未染色DNAラダーの添加し、別のレーンにはGelRed® Prestain Plus 6X DNA Loading Buffer(品番:41011)のような染色DNAラダーを添加しておくと、ゲル染色前の目視に便利です。
  • CF® 405S 〜 CF®594のような可視蛍光色素を用いる場合、UV波長での励起によって目視にてバンドを確認できます。650nm以上の遠赤外波長による励起では目視はできませんが、最適な励起/蛍光波長を設定した蛍光ゲルスキャナーを用いることで検出できます。
  • CF® 色素の蛍光は、ゲル染色による蛍光波長と重なる場合や互いに打消し合う場合があるため、CF® 色素の蛍光検出はゲル染色前に行ってください。

4.2 蛍光プローブによる撮影後、未染色DNAラダーやコントロール、PCR産物の検出のために、GelRed®GelGreen® などの核酸染色試薬を用いてゲルを後染めします。

  • 蛍光色素は、未染色PCR産物と比較すると標識DNAのDNAシフトを引き起こす可能性があります。

※Sephadexは GEヘルスケア社の登録商標です。
※Ventは NEB社の登録商標です。

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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては
使用しないように、十分ご注意ください。


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