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研究用

Dextramer® を用いた実験のコツ


Dextramer®による染色が成功するかどうかは、適切な実験デザインに大きく左右されます。一般的な染色手順外部リンクは、ほとんどの実験に適用されますが、異なるDextramer®試薬では、表示されるMHC-ペプチド複合体によって、異なる染色特性を有する可能性があります。
Dextramer®の実験を最適化するため、下記のさまざまなヒントやコツをご覧ください。

最適化のためのTips

Dextramer®染色に推奨されるネガティブコントロールは何ですか?

MHC Dextramer®試薬を用いた実験には、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを含める必要があります。
ネガティブコントロールの例:

  • MHC Dextramer®に陰性のT細胞クローンまたはT細胞株、またはネガティブドナー由来のPBMCの染色
  • サンプルと一致しないMHCアレルを有するMHC Dextramer®
  • ポジティブ反応が予測されない実験設定とは無関係なペプチドを運ぶMHC Dextramer®

Dextramer®染色に推奨されるポジティブコントロールは何ですか?

MHC Dextramer®試薬を用いた実験には、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを含める必要があります。
ポジティブコントロールの例:

  • 抗原特異的T細胞クローンまたはT細胞株、または陽性ドナー由来のPBMCの染色

Dextramer®染色手順をどのようにスピードアップできますか?

MHC Dextramer®および抗CD8抗体を混合し、同時にリンパ球に加え、4℃で20分間インキュベートした後、洗浄(一般的な染色プロトコル外部リンクのステップ5〜7)を行うことができます。 ただし、すべての抗CD8抗体クローンがこの染色手順に適しているわけではありません。 Immudex社の経験では、抗CD8抗体クローンSK1(BD)とKT15、YTS169.4(Dako)はこの特定の方法に用いることができますが、クローン53-6.7(BD)には使用できません。
【ご注意】MHC Dextramer®と抗CD8抗体を染色前に混合すると、一般的な染色プロトコルと比較してシグナル/ノイズ比が小さくなる可能性があります。

Dextramer®染色に推奨される抗体クローンはどれですか?

抗CD8および抗CD3抗体の中には、Dextramerの結合を妨げるものがあります。 使用する抗体がDextramer®の結合を妨げるかどうかを評価するために、実験前に抗CD8抗体および/または抗CD3抗体の抗体価の測定を推奨します。
Dextramer試薬と互換性のある抗体は以下の通りです。

  • 抗ヒトCD8抗体クローンSK1(BD由来)
  • 抗マウスCD8抗体クローンKT15/YTS169.4(Dako由来)
  • 抗ヒトCD3抗体クローンSK7(BD、eBiosciences社)/S4.1(Invitrogen社)/UCHT1(Dako社)
  • 抗マウスCD3抗体は非推奨

Dextramer®染色における非特異的結合をどのように減少させることができますか?

MHC-ペプチドの組み合わせによっては、MHC Dextramer®を用いることにより高い非特異的な染色を引き起こす可能性があります。この場合、MHC Dextramer®染色の前後に細胞を追加で洗浄することで、非特異的な結合を最小限に抑えることができます。
洗浄回数を増やしても問題が解決されない場合は、異なるインキュベーション時間と温度の比較検討が推奨されます。一般に、インキュベーションの温度を下げると培養の時間が長くなり、温度を上げると培養の時間が短くなります。
一般的には、10µLのMHC Dextramer®を用いる場合、推奨される細胞濃度は下記の通りです。

  • リンパ球細胞(1-3x106
  • クローナル抗原特異的T細胞(1-3x105

しかしながら、MHC-ペプチドの組み合わせによっては、MHC Dextramer®試薬の抗体価の測定が勧められる場合もあります。

Dextramer®染色と併用して細胞内染色を行うことはできますか?

フローサイトメトリー用のDako IntraStain and Fixation and Permeabilization Kitによる固定および細胞内染色は、MHC Dextramer®と併用することができます。 MHC Dextramer®を用いて良好な結果を得るためには、IntraStain Reagent Aの前に洗浄を追加することが必要です。

Dextramer®染色と組み合わせて固定を行うことはできますか?

固定前にサンプルの洗浄を推奨します。固定はMHC Dextramer®で染色後に行う必要があります。染色前の固定は推奨していません。 PBS中の2%ホルマリン(メタノールフリー)は、染色および洗浄の後、固定液として使用できます。
MHC Dextramer®は、Uti-Lyse™Erythrocyte-Lysing Reagent(Dako)などの固定・溶解用試薬と互換性があります。

Dextramer®染色を分析するために推奨されるゲーティング戦略は何ですか?

MHC Dextramer®陽性の細胞を可視化するためには、生リンパ球様細胞上にゲートを作成した後、MHC Dextramer®をx軸に、抗CD8抗体をy軸にとり、プロットを作成することが推奨されます。
死細胞は染色像を不明瞭にすることがあるので、生細胞をゲートすることがは非常に重要です。 細胞の生存率は>80%である必要があります。

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