MHC I／MHC II Dextramer® 染色プロトコール

• 関連商品：MHCマルチマー（デキストラマー）

蛍光標識MHC I／MHC II Dextramer®を用いて、抗原特異的CD8陽性T細胞およびCD4陽性T細胞を染色し、フローサイトメトリーにより検出します。1種類または複数種類のMHC Dextramer®試薬を、同一サンプルの染色に使用できます。

• Falcon製4 mLチューブ（12 × 75 mm）、または同等品
• Eppendorf製LoBind®チューブ、または同等品
• 染色・洗浄バッファー：1〜5% FCS含有PBS（pH 7.4）
• BD Horizon™ Brilliant Stain Buffer（品番：563794、BV421標識商品を使用する場合のみ）
• 100 µM d-Biotin（PBS、pH 7.4で希釈）
• 10× PBS（pH 7.4）
• 抗CD3、抗CD4、抗CD8抗体

1. PBMCの調製
   PBMCを解凍し、染色・洗浄バッファー10 mLで2回洗浄します（注A）。
2. 細胞懸濁液の調製
   PBMC 1〜3 × 10⁶個を、以下のバッファー50 µLに再懸濁します。クローン化細胞を使用する場合は、2〜5 × 10⁴個を使用します。
   - PE、FITC、APC標識商品：染色・洗浄バッファー
   - BV421標識商品：BD Horizon™ Brilliant Stain Buffer
3. MHC Dextramer®試薬の調製
   複数種類のMHC Dextramer®試薬を使用する場合は、1.5mL LoBind®チューブに（注B）、試薬1種類あたり以下を添加します。

   試薬	添加量
   100 µMd-Biotin	0.2 µL
   MHC Dextramer®	10 µL
   10× PBS	0.6 µL

   MHC Dextramer®を1種類のみ使用する場合は、d-Biotinおよび10× PBSの添加を省略できます（注C）。
4. 混合・遠心
   調製した混合液をボルテックスミキサーで短時間撹拌した後、10,000 × gで1分間遠心します。沈殿物を巻き込まないように注意してください。
   混合液は調製後すぐに使用し、保存しないでください。
5. MHC Dextramer®による染色
   MHC Dextramer®試薬を細胞懸濁液に添加し、短時間撹拌します。
   室温・遮光条件下で、以下の時間インキュベートします（注D）。
   

   使用する試薬	反応時間
   MHC IDextramer®	10分
   MHC IIDextramer®	30分
   MHC IとMHC IIの混合液	30分

6. 細胞表面マーカーの染色
   MHC Dextramer®による染色後、以下の抗体を添加します（注E）。

   使用する試薬	推奨抗体
   MHC IDextramer®	抗CD3、抗CD8抗体
   MHC IIDextramer®	抗CD3、抗CD4抗体

   必要に応じて、その他の細胞表面マーカーに対する抗体も添加できます。
   抗体の添加量・濃度は、各メーカーの推奨条件に従ってください。
7. 抗体反応
   室温・遮光条件下で20分間インキュベートします。
8. 洗浄
   染色・洗浄バッファー2 mLを加え、300 × gで5分間遠心した後、上清を除去します。 この操作を繰り返し、合計2回洗浄します（注F）。
9. 細胞の再懸濁
   細胞ペレットを、フローサイトメーターでの測定に適した量の染色・洗浄バッファーに再懸濁します。
10. フローサイトメトリー解析
    染色後は速やかに測定してください。すぐに測定しない場合は、2〜8℃の遮光条件下で保存し、2時間以内に測定することを推奨します。
    固定した細胞は、2〜8℃の遮光条件下で最大24時間保存できます（注G）。

染色時の注意事項
注A：使用可能なサンプル
MHC Dextramer®染色は、未固定の細胞であれば、各種細胞懸濁液、細胞株、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、全血などに適用できます。全血サンプルを使用する場合は、赤血球溶解処理の前にMHC Dextramer®染色を実施するか、細胞を固定しないタイプの赤血球溶解液を使用してください。

注B：試薬の保管
MHC Dextramer®試薬は、必ず2〜8℃の遮光条件下で保存してください。商品のプラスチック製バイアルには一定の遮光効果がありますが、完全に光を遮断できるわけではありません。

注C：d-Biotinおよび10× PBSの役割
d-Biotinは、染色時のアーティファクトを防ぐために必要です。また、10× PBSは、MHC Dextramer®混合液中の塩濃度を適切に調整するために添加します。

注D：インキュベーション時間の最適化
多数のMHC Dextramer®試薬を混合して染色する場合は、インキュベーション時間を延長する必要が生じることがあります。使用する試薬の組み合わせに応じて、適切なインキュベーション時間を検討してください。

注E：染色順序
抗CD3抗体および抗CD8抗体による染色は、MHC I Dextramer®との同時染色、またはその後に行うMHC I Dextramer®染色に悪影響を及ぼします。そのため、ほとんどの場合、MHC I Dextramer®による染色を先に行い、その後に抗CD3抗体および抗CD8抗体で染色することを強く推奨します。同時に染色すると、MHC I Dextramer®の染色強度が大幅に低下します。

注F：96ウェルプレートでの染色
96ウェルマイクロプレートでも染色を実施できます。その場合は、抗体とのインキュベーション後に、各ウェルあたり200 µLの染色・洗浄バッファーを使用して、合計4回洗浄してください。各洗浄工程では、300 × gで5分間遠心した後、上清を除去します。

注G：細胞の固定
MHC Dextramer®で染色した細胞は、PBSで調製した2%メタノールフリーホルマリンを使用して固定できます。固定したサンプルは、フローサイトメーターで測定する前に、染色・洗浄バッファーで洗浄し、再懸濁することができます。

解凍したヒト末梢血単核球（hPBMC）を用いて、MHC I Dextramer®により抗原特異的CD8陽性T細胞を同定するためのフローサイトメトリーのゲーティングのガイドラインを示します。

（A）リンパ球集団の選択
前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）のプロファイルに基づいて、リンパ球集団を選択します。

（B）シングレット細胞の選択
側方散乱光の高さ（SSC-H）と面積（SSC-A）のプロットを用いてシングレット細胞を選択し、細胞凝集体（ダブレット）を除外します。

（C）生細胞の選択
生死細胞判別用色素（FVS780）による染色結果に基づいて死細胞を除外し、生細胞集団を選択します。以降の解析には、この生細胞集団を使用します。

（D）CD3陽性・CD4陰性細胞の選択
CD4陽性T細胞およびNK細胞（CD8陽性・CD3陰性）を除外するため、CD3陽性・CD4陰性細胞集団を選択します。

（E）CD3陽性・CD8陽性T細胞の選択
続いて、CD3陽性・CD8陽性T細胞集団を選択します。

（F）抗原特異的CD8陽性T細胞の同定
MHC I Dextramer®で染色した細胞と、MHC I Dextramer® Negative Controlで染色した細胞のゲーティング結果を比較し、抗原特異的T細胞集団を同定します。

（G）MHC II Dextramer®によるCD4陽性ヘルパーT細胞の解析
MHC II Dextramer®またはMHC II Dextramer® Negative Controlで染色したCD4陽性ヘルパーT細胞のフローサイトメトリープロットを示します。

1サンプルの場合

2サンプルの場合
2サンプル以上の染色液をまとめて調製する場合は、分注時のロスを考慮して20%多めに調製します。