101 Bio（OBL）社　PureExom® Exosome Isolation kit (for serum & plasma)　プロトコル & トラブルシューティング

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• 商品詳細：PureExo® エクソソーム単離キット

※プロトコルは定期的に更新される可能性があるため、本情報は最新版ではない可能性がございます。 必ず製品付属のプロトコルをご確認ください。

キット構成品

重要ポイント：各反応で500µLを超える血清または血漿を処理しないでください。不明瞭な層の分離やカラムの目詰まりの原因となります。

1. 100〜500µLの血清または血漿サンプルを収集し、氷上に保管します。 凍結サンプルから始める場合は、サンプルを室温で完全に解凍してから、氷上に保管してください。 （血清/血漿の収集および調製手順については、こちらを参照してください）。
2. 血清/血漿サンプルを3,000×g、4℃で15分間遠心分離し、破片を除去します。
   重要ポイント：この手順をスキップすると、手順17でフィルターが目詰まりする可能性があります。
   オプション：高脂質含有量の血清/血漿サンプル（高脂血症患者の血清サンプルなど）を処理する場合は、ペレットを乱さずに上清を新しい遠心チューブに移します。 上清を4℃で2時間インキュベートし、次に1,000x g、4℃で10分間遠心分離し、脂肪の沈殿を取り除きます。
3. ペレットを乱すことなく、100〜500µLの透明な上清を15mLの遠心チューブに移します。 上清にサンプルバッファーを加えて、希釈した血清/血漿サンプルの総量を2 mLにし、氷上に静置します。 この希釈は、開始容量100〜500µLでうまく機能します。 1回の反応で500µLを超えるサンプルを処理しないでください。
4. 1.5mLのマイクロ遠心チューブに、溶液A、B、Cを次の順序で加えて0.9mLの混合物A / B / Cを調製します（常にこの混合物A / B / Cを使用直前に調製します。混合物A / B / Cは保存できません。）
   1回目の添加溶液A：0.3 mL
   2回目の添加溶液B：0.3 mL
   3回目の添加溶液C：0.3 mL
   ※蒸発を防ぐため、使用後はすぐにボトルにキャップをしてください。
5. 混合物A/B/Cを10秒間ボルテックスし、均一にします。
6. 0.9mLの混合物A / B / Cを2mlの希釈血清/血漿サンプルに加えます（ステップ3のサンプル）。
7. 15mLチューブに蓋をし、チューブを少なくとも10回静かに反転させてよく混合し、4℃で30分間インキュベートします。
8. チューブを5,000×gで3分間遠心させます。
9. A . 混合物が以下の3つの異なる層に見えるようになります。
   
   
   middle fluffy layerを乱さないで、ステップ10に進みます（3つの異なる層がない場合にのみステップ9Bを参照してください）。
   
   

   B. 一部のサンプルでは、層の分離が明確ではありません。 下の図に示すように、3つの層が不正確に表示されます。Top cloudy layer（水層）、middle whiteccloudy layer（上部層よりも厚く、透明度が低い）、bottom colorless layerです。
   
   
   
   最上層を注意深く取り除き、廃棄します。middle whiteccloudy layerを乱したり、取り除いたりしないように注意してください。(エクソソームがこの層に存在するため)
   ステップ4と5の説明に従って、さらに0.9mLの混合物A / B / Cを準備し、middle white cloudy layerとbottom colorless layerを含むチューブに追加します。 チューブを少なくとも10回静かに反転させて、よく混合します。 4℃でさらに30分間インキュベートします。 その後、チューブを5,000×gで3分間遠心させます。 これで、ステップ9Aに示すように、混合物は3層として表示されます。 次に、ステップ10に進みます。

10. top transparent layerをピペットで取り出し、middle whiteccloudy layerを乱さずに廃棄します。middle whiteccloudy layer（エクソソームはこの層に存在）を新しい1.5mlマイクロ遠心チューブに移します。 5,000×gで3分間遠心する。 遠心後、新しく3層に分離：top transparent layer、middle whiteccloudy layer、bottom colorless layer（下図を参照）。
    重要ポイント：すぐに次のステップに進んでください。
    
11. top transparent layerをピペットで取り出し、廃棄します。 ピペットチップをチューブの底まで挿入して、底の無色の層を完全に取り除き、廃棄します。 チューブにはmiddle whiteccloudy layerのみを入れてください。 （エクソソームはこの層にあります。）
    
12. 5,000x gで3分間再度遠心すると、3つの層が再び現れます。 ここで、ステップ11をもう一度繰り返します。 これで、「fluff pellet」だけがチューブに残ります。 この実験例では、「fluff pellet」の容量は約25µLです。
13. チューブキャップを開いたまま、室温で5〜10分間風乾します（過度に乾燥させないでください）。
14. 収集したfluff pelletの4倍量の1×PBSをチューブに加えます。 この実験例では、100µLのPBS（4x25µLのfluff pellet）を追加しました。fluff pelletを40回激しく上下にピペッティングして再懸濁します。
15. チューブを水平シェーカーで3分間高速で振盪後、激しくピペッティングする操作を10回繰り返します。これをさらに2回繰り返します。
    重要ポイント：fluff pelletが十分に再懸濁されていない場合、エクソソームがfluff pellet中に閉じ込められ、エクソソームの純度と収量が低下する可能性があります。例えば。 高脂血症患者のサンプルでは、fluff pelletを解離してエクソソームを放出することは困難です。 このような場合は、このステップでピペッティングと振盪時間を延長してください。
16. チューブを5,000xgで5分間遠心します。 「fluff pellet」を乱さずに、上清を1つのPureExo®カラム（付属）に慎重に移します。
    重要ポイント：「fluff pellet」は4℃に保ってください。 実験が終了するまで廃棄しないでください。
17. PureExo®カラムを3,000×gで5分間遠心して、分離された純粋なエクソソーム（PBSに懸濁されたエクソソーム）である「flow-through」を回収します。

分離されたエクソソームは、下流のアッセイに直接使用することも可能です（例：101Bio Exosomal RNA and Protein Extraction Kit,　品番： P200を使用してエクソソームRNA/Proteinを抽出）。また、4℃で1週間、または-80℃で3ヶ月間保存することも可能です。濃縮したエクソソームは、放置すると沈殿します。ご使用の際には、ピペッティングを行い、再度よく懸濁してください。

1. 最終的なエクソソームの収率が低い場合。
   • カラムに液体が残っていないか確認してください。残っている場合は、汚染されたタンパク質によってカラムが目詰まりしていることを示しています。目詰まりの原因としては、ステップ2でデブリが完全に除去されていない、サンプル中の脂質タンパク質が多すぎる（例：高脂血症）、ステップ16で沈殿物をピペッティングした、サンプルの投入量が多すぎる、などが考えられます。目詰まりが発生した場合は、再度サンプルを準備し、サンプルの量を減らし、ステップ2と16にご注意ください。
   • サンプルの種類によっては、fluff（ステップ15）に粘着性があり、fluffからエクソソームを放出することが困難な場合があります。(エクソソームの一部がfluffに捕捉されている可能性があります。)最終のflow-throughを4℃で保存したfluffペレットに戻し（ステップ16から、エキソソームはこのfluffペレットにトラップされています）、EDTAを最終濃度3mMになるように加えます。
     

     例えば、0.5M EDTAストック溶液（500mM EDTA）を使用する場合、100µLのflow-throughに0.6µLのEDTA原液を加える必要があります。計算方法は以下の通りです。
     EDTAストック液容量＝（最終総容量×最終濃度）／EDTAストック液濃度
     = (100 µL x 3 mM) / 500 mM
     = 0.6µL
     勢いよく60回ピペッティングし、チューブを水平シェーカーで20分間振盪します。振盪中に、上下に激しくピペッティングすることを数回繰り返します。別のPureExo®カラムを通過させてエクソソームを回収します。

   • サンプルタイプによっては、エクソソームの含有量が少ない場合があります（ステップ9Aで中央のfluff層が薄くなっています）。より多くのエクソソームを回収するために、初期投入サンプル量を増やしてください。
2. Flow-throughに複数の層がある場合。
   ステップ11-12の間、fluffにbottom layerが残っていた場合、チューブを5,000×gで3分間遠心し、底層を注意深くピペッティングして捨てます。新しいカラムにサンプルを通し、流れてきたものを回収します。
3. エクソソームの収率は良好だが、エクソソームのタンパク質レベルが低くなっている場合。 エクソソームの膜は、細胞よりも溶解しにくい為、RIPAバッファーなどの通常の細胞用溶解バッファーでは、エクソソームを完全に溶解してエクソソームタンパク質を抽出するには不十分です。エクソソームのタンパク質を抽出するには、Exosomal RNA and Protein Extraction Kit (品番：P200)の使用をお勧めします。
4. エクソソームの収量は良好だが、エクソソームRNAレベルが低い場合。
   ●RNAの分解が起こっている場合があります。RNase freeの作業環境をご確認ください。
   ●エクソソームRNAの抽出には、品番：P200キットの使用をお勧めします。
5. Exosomal RNAの収量は良好だが、RT-PCRによる増幅が得られない場合。
   ●内部コントロールの増幅を確認してください。
   ●プライマーの感度を確認してください。