セルバイオラボ社 レンチウイルスによる遺伝子デリバリー プロトコール内で使用した商品
技術情報
セルバイオラボ社 レンチウイルスによる遺伝子デリバリー
使用するキット
● QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit(品番:VPK-107)
【構成内容】
- ViraBind™ Lentivirus Reagent A(100X)
- ViraBind™ Lentivirus Reagent B(100X)
- Sample Diluent
- Anti-p24 Antibody Coated Plate
- FITC-Conjugated Anti-p24 Monoclonal Antibody
- HRP-Conjugated Anti-FITC Monoclonal Antibody
- Assay Diluent
- 10X Wash Buffer
- Substrate Solution
- Stop Solution
- Recombinant p24 Standard
プロトコール
I:スタンダードカーブの調製
- 下記の通りスタンダードカーブを作成します。
- p24 stock solution をサンプル希釈液で溶解し,ボルテックスにより良く溶かして37℃で30分間インキュベートします。
Standard Tubes | Recombinant p24 Standard(μL) | Sample Diluent(μL) | p24(ng/mL) |
---|---|---|---|
1 | 10 | 990 | 100 |
2 | 500 of Tube #1 | 500 | 50 |
3 | 500 of Tube #2 | 500 | 25 |
4 | 500 of Tube #3 | 500 | 12.5 |
5 | 500 of Tube #4 | 500 | 6.25 |
6 | 500 of Tube #5 | 500 | 3.125 |
7 | 500 of Tube #6 | 500 | 1.5625 |
8 | 0 | 500 | 0 |
II:レンチウイルスサンプルの調製と不活化
- (オプション)レンチウイルス上清を新しい培養培地に溶かし,1mL になるように調節します。ネガティブコントロールとして,培養培地のみのものも使用します。
※サンプルが不明の場合,それぞれのサンプルの希釈液を数種類作成することを推奨します。 - 10μL のViraBindTM Lentivirus Reagent A を加え,ゆっくりと混合し,すぐに10μL のViraBindTM Lentivirus Reagent B を加えます。
37℃で30 分間インキュベートします。 - 12,000 rpm で5分間遠心し,上清を注意深く取り除きます。ペレットを250μL のサンプル希釈液で懸濁し,ボルテックスでよく混合します。ウイルスを不活化するために,37℃で30分間インキュベートします。
III:アッセイ方法
- 使用する前に全ての試薬をプロトコールにそって,準備してください。
- それぞれのレンチウイルスサンプル,HIV p24 スタンダード,ブランク,コントロールをduplicate でアッセイします。
- 100μL の不活化したレンチウイルスサンプルとp24 抗原スタンダードを抗p24 抗体でコートされたプレートに加えます。
- プレートカバーでカバーし,37℃で少なくとも4 時間以上,または4℃で一晩インキュベートします。
- カバーおよび,空ウェルを外します。マイクロウェルストリップを3回250μl の洗浄バッファーで洗浄します。(それぞれの洗浄ステップでは, ウェルから洗浄液をアスピレーションによって取り除いてください)
最後の洗浄で,ウェルを空にし,パットまたはペーパータオル上でタッピングして残りの洗浄バッファーを取り除いてください。 - 100μL の希釈した FITC 標識 Anti-p24 モノクローナル抗体を加えます。
- プレートカバーでカバーし,orbital shake を用いて室温で1時間インキュベートします。
- プレートカバーを外し,ストリップを3回Step 5 と同様に洗浄します。
- 100μL の希釈した HRP 標識Anti-FITC を加えます。
- プレートカバーでカバーし,orbital shake を用いて室温で1時間インキュベートします。
- プレートカバーを外し,ストリップを3回Step 5 と同様に洗浄後,すぐに次のステップに進んでください。
- 基質を室温に戻し,100μl をブランクを含む全てのウェルに加えます。orbital shake を用いて室温で1時間インキュベートします。実際には, 2-30分間の場合もあります。
※プレートを注意深く観察し,色がすぐに変化した場合,すぐに反応を止める必要があります。 - ブランクを含む全てのウェルに 100μl の停止液を加えて酵素反応を止め,450nm で測定します。