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研究用

Rhoキナーゼの活性を測定するキットROCK 活性アッセイ

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ROCK 活性アッセイキットは、放射性物質を用いずに、細胞または組織ライセート中のRhoキナーゼ(ROCK)の活性レベルを測定するキットです。

イムノブロットキットは少量サンプルで、また ELISAに類似した手法の 96ウェル活性測定キットはハイスループットなROCK活性の測定やROCK阻害剤のスクリーニングに便利です。ROCKの基質として MYPT1 を使用し、ROCKキナーゼの活性を MYPT1 リン酸化抗体によって検出します。(→ ROCK 活性アッセイの原理) 

背景

Rhoキナーゼ  ROCK

Rhoファミリーのメンバーは、シグナル伝達経路の重要な調節因子で、アクチン細胞骨格の再編成を介して細胞運動、細胞接着、細胞質分裂を指示します。Rho は、リゾホスファチジン酸(LPA;lysophosphatidic acid)などの細胞外シグナルによって活性化されます。Rho の作用は、下流のRhoエフェクターによって媒介されます。

Rhoエフェクターの一つとして、Rhoキナーゼ(ROCK;Rho-associated kinase)があります。これまでに、二種類の ROCK アイソフォーム、ROCK-I(別名:ROKβ)および ROCK-II(Rho Kinase/ROKα)が同定されています。ROCKは、いくつかの基質のリン酸化を介して、Rhoシグナル伝達およびアクチン細胞骨格の再編成を媒介し、アクチンフィラメントの集合と収縮を誘導します。例えば、 ROCK は、MYPT1 subunit 1の Thr696 を標的として特定のミオシンホスファターゼをリン酸化することで ミオシンホスファターゼを不活性化し、結果として 20-kDa ミオシン軽鎖(MLC20)のリン酸化量が増加します。

特長

  • 非RIアッセイで安心
  • イムノブロット と ELISA の2通りのフォーマットを用意
  • ポジティブコントロールとして 活性型ROCK-II が付属

構成内容

96ウェル活性アッセイキット
  • ROCK基質(リコンビナントMYPT1)
    コート済みプレート
  • キナーゼバッファー(10×)
  • ATP試薬
  • MYPT1リン酸化抗体
  • 二次抗体(HRP標識)
  • 活性型ROCK-II
  • アッセイ希釈用試薬
  • 洗浄バッファー(10×)
  • 基質試薬
  • 停止液
イムノブロットキット
  • ROCK基質(リコンビナントMYPT1)
  • キナーゼバッファー(10×)
  • ATP試薬
  • MYPT1リン酸化抗体
  • 二次抗体(HRP標識)
  • 活性型ROCK-II
 

ROCK 活性アッセイの原理

96ウェルROCK活性アッセイキットの原理
96ウェル ROCK 活性アッセイキットの原理
ROCKイムノブロットキットの原理
ROCK 活性イムノブロットキットの原理
 

ROCK 活性の測定例

ROCK-II 活性アッセイ
図1. ROCK-II 活性アッセイ
(左)10μLの活性型ROCK-II を90μLの1×キナーゼ反応バッファーに加え、30℃で60分間反応させた。
(右)2.5ngの活性型ROCK-II を90μLの1×キナーゼ反応バッファーに加え、30℃で各時間反応させた。

 

 ROCK-II 活性測定イムノブロットアッセイ
図2. ROCK-II 活性測定イムノブロットアッセイ
MYPT1基質のリン酸化をMYPT1リン酸化(Thr696)抗体で検出した。測定は添付のプロトコールに従った。
10ng の活性型ROCK-IIを含む1×キナーゼバッファー25μL、0.2mM ATPを含む1×キナーゼバッファー50μL、リコンビナントMYPT1を30℃で30分間反応させた。キナーゼの反応を、25μLの4×SDS- PAGEサンプルバッファーを加えて停止した。各レーンに下記サンプルをロードし、SDS-PAGEを行った。MYPT1のリン酸化の検出は、 MYPT1(Thr696)抗体を用いて行った。
レーン1, 3, 5, 7:キナーゼなし(ネガティブコントロール)、
レーン2, 4, 6, 8:キナーゼ200ng, 100ng, 50ng, 25ng。

ROCK 活性アッセイ

96ウェル ROCK 活性アッセイキット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
96-Well ROCK Activity Assay Kit詳細データ CBL STA-416 96 ASSAY
¥139,000
96-Well ROCK Activity Assay Kit詳細データ CBL STA-416-5 5*96 ASSAY
お問い合わせ

ROCK 活性イムノブロットキット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
ROCK Activity Immunoblot Kit詳細データ CBL STA-415 20 ASSAY
¥99,000
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