qPCR や HRM に最適な SYBR® Green を代替試薬 EvaGreen® 蛍光色素（20X）

定量リアルタイムPCR(qPCR)にお使いいただける優れた蛍光試薬です。EvaGreen® の吸収及び発光スペクトルはSYBR® GreenやFAMと類似していますので同じ設定でお使いいただけます。

• EvaGreen® 蛍光色素（20X）
• Fast EvaGreen® Master Mixes

• PCR阻害が非常に小さい：
  SYBR® Green I とは異なり、PCR阻害が非常に小さい。
• 蛍光シグナルが高い：
  EvaGreen® は濃度が比較的高いため、SYBR® Green I よりも非常に強いPCRシグナルを得ることができます (図1)。また色素再分布 (dye redistribution) のような問題も排除できるので マルチプレックスPCR や高解像度融解曲線分析 (high-resolution melt curve analysis：HRM) に適しています。この技術は遺伝子型解析やヘテロ二本鎖検出によく用いられています。EvaGreen® を使ったqPCR は Fast PCRプロトコールもご利用いただけます (図2)。
• 非常に安定：
  室温状態でPCR操作をしても分解されることはありません。バッファー中の色素は室温もしくは冷蔵庫で安定して保存ができます。また凍結融解を繰り返しても安定しています。一方で SYBR® Green I は不安定であることが知られており、分解された色素はPCR 阻害をさらに引き起こしてしまいます。
• 安全：
  EvaGreen® は細胞膜不浸透性なので SYBR® Green I よりも安全な色素です (図5)。

図1 EvaGreen® (赤色)、I社試薬、A社試薬 を使用した Myc 遺伝子断片 (75ng huDNA input) の増幅
全反応は Universal cycling プロトコール (95℃で15秒間、60℃で60秒間) を使った ABI7900装置で2回行った。

図2 GAPDH 増幅における EvaGreen® Master Mix と A社試薬 の比較。
2-stage Universal Cyclingでは、95℃で15秒間、60℃で様々な増幅/伸長時間 (各60、40、20 そして 10秒) を使用した。各水平線は、8回の繰り返し実験のCt分配を示す。データは60秒から10秒の増幅/伸長時間の短縮が EvaGreen® Master Mix を使った場合Ctで1サイクルのみの遅延を示した。A社試薬を使った場合、Ctで5〜6サイクルの遅延がみられ再現性の低さを示した。

図3 Rotor Gene 6000で EvaGreen® を使った高溶解度曲線解析 (HRM) において、3つの異なる遺伝子型、変異型(赤)、ヘテロ変異型 (紫)、野生型 (青) を明確に区別した。
（本データは Corbett Research社に寄稿していただきました)。

図4 PBSバッファー中の二本鎖DNA における EvaGreen® の発光、励起スペクトラム

図 5 HeLa細胞を SYBR® Green I (1.2μM、左) もしくは EvaGreen® (0.2μM、右) のいずれかで 37℃でインキュベートしたのち蛍光顕微鏡で観察した。
EvaGreen® で30分間インキュベートしたものでは細胞染色が見られなかった。これはEvaGreen® が細胞膜を通過しなかったことを示している。しかし SYBR® Green I では5分以下のインキュベートで強い細胞内染色が見られた (データなし)。30分後、SYBR® Green I は細胞核を濃緑色 (左図) に染色した。

※  表示価格について