記事ID ： 10585

Arf1とArf6の活性を2種類（G-LISA、プルダウン）の方法で測定 Arf1 / Arf6 活性アッセイキット

メーカー名：Cytoskeleton, Inc.

Arf1とArf6 それぞれの活性を2種類（G-LISA定量法、プルダウン法）の方法で測定するキットを販売しています。

背景

Arf1 / Arf6　について

GTPaseスーパーファミリーのサブファミリーである、哺乳類のADPリボシル化因子（Arf）には、6つのArfアイソフォーム（Arf1-Arf6）があります。

現在では、Arf1とArf6がArfの研究対象の中心となっています。Arf1は、ゴルジ体を介する小胞体と細胞膜の間の順方向・逆方向の輸送で機能しています（図1）。Arf6は、エンドサイトーシスやアクチン細胞骨格リモデリングの調節に親密に関係しています（図2）。

Arf1及びArf6は他のGTPaseと同様に不活性なGDP結合型と活性型のGTP結合型を循環します。GTP/GDP結合型のサイクルは、GAPs及びGEFsにより調節されます。

図1　ゴルジ体の小胞形成期において、Arf1がアクチンの組み立てを調節

図2　Arf6の細胞周辺での膜輸送及びアクチン細胞骨格再編成に関連する機能

使用目的

Arf1とArf6を測定するためのキットとして、G-LISAアッセイとプルダウンアッセイの2つのフォーマットをご用意しました。
G-LISAアッセイでは、活性型Arf1とArf6に選択的に結合するエフェクタータンパク質でコートした96ウェルプレートを用い、ELISA技術を用いて定量化します。

プルダウンアッセイでは、GTP結合型Arf1とArf6に特異的に結合するエフェクタータンパク質GGA3（Golgi-localized g-ear containing, Arf-binding protein 3）の、Arf1とArf6のタンパク質結合ドメイン（PBD）を利用します。着色したセファロースビーズと共有結合させたGGA3-PBDでプルダウンし、ウェスタンブロットにより活性型Arf1-GTPとArf6-GTPを定量することが可能です。

構成内容

G-LISA アッセイ（品番BK132、BK133）

96ウェル Arf-GTP結合プレート（8ウェルごとの12ストリップに分割できます）
抗Arf抗体
HRP標識二次抗体
Arfコントロールタンパク質（恒常的活性型Arf）
細胞溶解バッファー
洗浄バッファー
抗原提示バッファー
抗体希釈バッファー
HRP検出試薬A、B
HRP停止溶液
Precision Red™ advanced タンパク質アッセイ試薬（品番ADV02）
プロテアーゼ阻害剤カクテル（品番PIC02）

プルダウンアッセイ（品番BK032-S、品番BK033-S）

GGA3-PBD ビーズ（品番GGA05)
Arfモノクローナル抗体
His標識Arfタンパク質
GTPγS（非加水分解性のGTPアナログ）（品番BS01）
GDP
細胞溶解バッファー
洗浄バッファー
ローディングバッファー
停止バッファー
プロテアーゼ阻害剤カクテル（品番PIC02）
DMSO

使用例

図3　ARNOによるArf活性化実験例（Dr. Lorraine Santy (Penn State University) 提供）
MDCK細胞にアデノウイルスベクターを導入
左：コントロールベクター
中央：E156K変異myc標識ARNOタンパク質をコードしたベクター
右：野生型myc標識ARNOタンパク質をコードしたベクター
ARNOタンパク質は、myc一次抗体（9e10）及びCY2標識二次抗体で緑色に染色し、F-アクチンをローダミンファロイジンで赤色に染色した。野生型のARNOタンパク質を発現させた細胞には糸状仮足が認められた（右図の矢印）が、触媒不活性型のARNO変異タンパク質を発現させた細胞ではこのような細胞の突出は認められなかった（中央）

図4　Arf6 G-LISA アッセイ例
MDCK細胞を2時間培養（Activated：組織培養プレートに接着、Control：懸濁）し、ライセートを調製した。ライセートを12.5μg、6.25μg、3.1μg、使用し、G-LISAアッセイ（品番BK133）を行い、490nmにおける吸収を測定した。データはバックグラウンドを差し引いた値。

図5　Arf1 プルダウンアッセイ例
上段：MDCK細胞ライセート（500μg）をGDPもしくはGTPγSと共にプルダウンアッセイ（品番BK032-S）を行った。
下段：C2C12細胞ライセート（500μg）を20μgのGGA3-PBDビーズと共にインキュベートし、プルダウンアッセイ（品番BK032-S）を行った。
（FBS：未処理、SF：血清飢餓で1時間処理した細胞）
ビーズサンプルは、20μLのサンプルバッファーに再懸濁し、4-20％SDS-PAGEゲルで分離した。PVDFに転写し、Arf1抗体でプローブした後、化学発光で検出した。

Arf1 / Arf6 活性アッセイキット

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
Arf1 G-LISA Activation Assay Kit	CYT	BK132	96 ASSAY	販売終了
Arf1 Pulldown Activation Assay Kit	CYT	BK032-S	20 ASSAY	￥160,000
Arf6 G-LISA Activation Assay Kit	CYT	BK133	96 ASSAY	販売終了
Arf6 Pulldown Activation Assay Kit	CYT	BK033-S	20 ASSAY	￥160,000
GGA3-PBD Beads	CYT	GGA05-A	1*500 UG	販売終了

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
Precision Red Advanced Protein Assay (1X conc)	CYT	ADV02-A	1*500 ML	￥47,000
Precision Red Advanced Protein Assay (1X conc)	CYT	ADV02-B	3*500 ML	￥118,000
Protease Inhibitor Cocktail	CYT	PIC02	1*1 ML	￥26,000
GTP γ S	CYT	BS01	1*500 UG [100mM]	CYT社 BS01 50 を参照