ビーズが見やすい！活性型 GTPase をプルダウンで測定するキット 低分子量 GTPase 活性化アッセイ

低分子量 GTPase 活性化アッセイキットは、色がついて見やすいアガロースビーズを用いて、活性型の低分子量 GTPase を選択的にプルダウンするアッセイキットです。沈殿した GTPase は、キットに含まれる抗体を用いてウェスタンブロッティングで検出します。

低分子量 GTPase（GTP アーゼ）

低分子量 GTPase（GTP アーゼ） にはRas、Rho、Rab、Arf ファミリーなどがあり、シグナル伝達経路において分子調節因子として働きます。分子量約100kDaのヘテロ三量体Gタンパク質とは異なり、低分子量 GTPase の分子量は約20-30kDa で、GDP結合型（不活性型）あるいはGTP結合型（活性型）として単量体で存在しています。GDP 結合型とGTP 結合型との間を行き来するための因子が細胞内に存在し、GDP型からGTP型に変換させて低分子量GTPaseを活性化させるタンパク質をグアニンヌクレオチド交換因子（GEF；Guanine nucleotide exchange factor）と呼びます。反対に、GTP 型をGDP 型に加水分解することで低分子量 GTPase を不活性化させるタンパク質を GTPase 活性化タンパク質（GAP；GTPase activating protein）と呼びます。すなわち、低分子量GTPaseはGEFとGAPにより “ON”、“OFF” の状態を制御されています。

• 短時間でアッセイ終了：インキュベーション（1時間）、電気泳動、ウェスタンブロッティングで実験終了。
• 安全：放射性同位体は使用しません。
• 目視によるチェック：アガロースビーズは目に見えるので、確認しながら操作ができます。
• コントロール付き：ウェスタンブロッティングのコントロールつきです。

• アフィニティーアガロースビーズ*
• 抗体*
• TPγS（100X）
• Assay/Lysis Buffer（5X）
• GDP（100X）
• GTPase WBポジティブコントロール

*キットにより内容物が異なります

Fig.2 アッセイ原理
PBD:p21-binding domain

Fig.3 Rac Activation Assay （品番STA-401）を用いたウェスタンブロッティング
レーン1：GTPase WBポジティブコントロール
レーン2：293細胞ライセートをGDPと一緒に流し、PAK1 PBDアガロースビーズとインキュベーション
レーン3：293細胞ライセートをGTPγSと一緒に流し、PAK1 PBDアガロースビーズとインキュベーション

Fig.4 Arf1 Activation Assay（品番：STA-407-1）を用いたウェスタンブロッティング
（左）GTPaseウェスタンブロッティング用ポジティブコントロール
（右）
レーン1：HeLa細胞ライセートをGDPと一緒に流し、GGA3 PBDアガロースビーズとインキュベー ション
レーン2：HeLa細胞ライセートをGTPγSと一緒に流し、GGA3 PBDアガロースビーズとインキュ ベーション

• Arf Activation Assays
• Cdc42 Activation Assays
• Rac Activation Assays
• Ral Activation Assay

• Ran Activation Assay
• Rap Activation Assays
• Ras Activation Assays
• Rho Activation Assays

• ［関連］アガロースビーズ

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