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FAQ : セルバイオラボ(Cell Biolabs)社 低分子量 GTPase アッセイビーズ

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【01】 低分子量 GTPase アッセイビーズ (Raf-RBD, PAK1-PBD, Rhotekin-RBD)は種特異的ですか?

特定の低分子量 GTPase は、配列のアライメントによると、種間において大部分は1,2個のアミノ酸変異が存在します。それゆえに、セルバイオラボ(Cell Biolabs)社のビーズと一次抗体は多くの種に交差すると考えられます。

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【02】 ビーズを使用した詳細なプロトコルは?

これらのビーズのためのプロトコルは、セルバイオラボ社の GTPase 活性アッセイと類似しています。以下がプルダウンアッセイのプロトコルです。

  1. 細胞ライセートをマイクロチューブに 0.5-1 mL に分注します。
  2. 1× Lysis buffer を用いサンプルを 1 mL に調製します。
  3. 完全にアガロースビーズスラリーをボルテックスし懸濁します。
  4. 40μL のビーズスラリーを各チューブに素早く加えます。
  5. チューブを 4℃ で1時間優しく撹拌しながらインキュベートします。
  6. 14,000×g で10秒間遠心分離し、ビーズをペレットにします。
  7. ビーズペレットを動かさないように注意しながら、上清をアスピレート、廃棄します。
  8. ビーズを 0.5 mL の 1× Lysis buffer で3回洗浄し、それぞれ遠心分離とアスピレートを行います。
  9. 最後の洗浄の後に、ビーズをペレットにし、上清を注意深く除きます。
  10. ビーズペレットを 40μL の 2× 還元 SDS-PAGE サンプルバッファーに溶解します。
  11. サンプルをそれぞれ5分間ボイルします。
  12. サンプルを 14,000×g で10秒間遠心分離します。
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【03】 これらのビーズを用いて最良の結果を得るためには?

これらビーズを用いて最良の結果を得るためには、プルダウン前にブロットで検出できる細胞ライセートの量を最初に決定することが重要です。セルバイオラボ社では、ウェスタンブロットでライセートの滴定を行い、良いシグナルを得られるライセート量を滴定することを推奨します。GTPase アッセイではその100倍量を添加します。例えば 5, 10, 20 ug のライセートをウェスタンブロットし、10ug で良好なシグナルが観察されたら、プルダウンアッセイには 10 ug×100 = 1mg を用いるということです。

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【04】 推奨のライセート量を使用しましたが、プルダウンアッセイにおいて活性型フォームを見ることができませんでした…

サンプル中の低分子量 GTPase の活性型レベルは、どの程度プルダウンされるかによって決定されます。ビーズは GTP フォームの低分子量 GTPase のみプルダウンするようデザインされています。もしサンプル中の GTPase が主に GDP フォーム(不活性型)であれば、ロードしたライセート量に関わらずプルダウンされません。ライセートは GTPgs と共にプレロードし、ポジティブコントロールとして使用することができます。

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