商品詳細 「Global DNA メチル化 ELISA キット」
対象商品： STA-380
このキットはDNA抽出が可能であれば、どんなサンプルも用いることができます。それゆえに、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から抽出したDNAも使用することができます。
はい。DNAの消化は、このアッセイにとって重要です。なぜならDNAは、単一のヌクレオチドとして抗体に認識されるからです。処理していないサンプルまたは正しく消化されていないサンプルは、認識されず、結果の信頼性はなくなります。
セルバイオラボ社では、下記の試薬の使用をおすすめしますが、他の市販されている試薬でも問題ありません。
ヌクレアーゼP1： Sigma社, #N8630
アルカリフォスファターゼ： Sigma社, #P5931
ガイドラインとして、下記に例を示します。
- 細胞または組織サンプルからのDNAの抽出は、確立された方法または市販のDNA抽出キットを用いて行います。抽出されたDNAは、1 mg/mLになるように水に溶解します。
- チューブに135 μLのDNAサンプルを加え、DNAサンプルを95℃で5分間インキュベートし、すぐに氷の上で冷却し、1本鎖DNAにします。
- 200 mM 酢酸ナトリウム (pH 5.2),5ユニットのヌクレアーゼP1 (例：Sigma社#N8630を30 mM酢酸ナトリウム(pH 5.2) +5 mM 塩化亜鉛で溶解) を15μL加え、37℃で2時間インキュベートすることでDNAサンプルを変性させます。
- 1M Tris (pH 7.5),5ユニットのアルカリフォスファターゼ(例：Sigma社#P5931 を1 mM 塩化マグネシウムで溶解) を15μL加え、37℃で1時間インキュベーションします。
- 反応液は、6,000×gで5分間遠心し、上清を5MedCyd ELISAアッセイに用いるかまたは、-20℃で6ヶ月保存することが可能です。
ノート： ヌクレアーゼ消化溶液の50μLをキットに用いると、約40μgのDNAが使用されます。
スタンダードカーブから濃度を決定するための最良の方法は、4-PLカーブフィッティングプログラムを使用することですが、ソフトウェアを持っていない場合は、Excelを使用することができます。スタンダードカーブをプロットする場合、X軸を対数スケールにし、直線または対数近似曲線を作成します。ELISAのスタンダードカーブは通常、直線にはなりませんが、サンプルが残ったポイントの間に収まる限り、高濃度と低濃度の値をカーブから除くことで直線のカーブを作成することができます。スタンダードの中間の部分は最も感度が良く、サンプルを定量するのに使用する一番良い部分です。
