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FAQ : セルバイオラボ(Cell Biolabs)社 低分子量 GTPase 活性アッセイ

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【01】 本キットでサンプル中の低いレベルの活性低分子量 GTPase を検出できるかどうか懸念しています。良い結果を得るための最良の方法は?

セルバイオラボ(Cell Biolabs)社の低分子量 GTPase 活性アッセイを用いた結果を改善するためにできることは以下の2点です。

  1. プルダウンする前に、そもそも目的タンパク質がプルダウンせずに検出可能であることを確かめることが良いでしょう。ご自身のライセートサンプルをキット付属の抗体を用いてウエスタンブロッティングして確認できます。
  2. プルダウンする時に出来る限り多くのライセートを用います。活性型の small GTPase は通常、細胞内に微量しか存在しておらず、上述のウエスタンブロットではっきりとしたバンドが検出するのに必要な量の約100倍のライセートを使用することをおすすめします。
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【02】 活性型 Ras ファミリーメンバーの機能について研究しています。セルバイオラボ社の低分子量 GTPase 活性アッセイの代わりに、通常のウェスタンブロットで活性型を検出することはできますか?

活性型 small GTPase を検出するに際して、ウエスタンブロットに頼りきることは推奨しておりません。セルバイオラボ社では確実に活性型 GTP を認識して、かつ不活性型 GDP を認識しない特異的な抗体を認知しておりません。

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【03】 低分子量 GTPase アッセイビーズ (Raf-RBD, PAK1-PBD, Rhotekin-RBD) は種特異的ですか?

特定の低分子量 GTPase は、配列のアライメントによると、種間において大部分は1,2個のアミノ酸変異が存在します。それゆえに、セルバイオラボ社のビーズと一次抗体は多くの種に交差すると考えられます。

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【04】 これらのキットは組織ライセートサンプルに使用できますか?

はい。セルバイオラボ社の低分子量 GTPase 活性アッセイは、組織ライセートサンプルに適合します。組織サンプルは、20-50 mg/mL の濃度で 1× Assay/Lysis buffer または他のライシスバッファー(プロテイナーゼインヒビターを含む)に懸濁します。ホモジナイズ後に、スピンし、上清をライセートとして回収します。

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【05】 異なるライシスバッファーを使用することは可能ですか?

RIPA バッファーのような異なるライシスバッファーを用いることは可能です。5× アッセイバッファーのレシピは、以下の通りです。5X Assay/Lysis Buffer: 125 mM HEPES, pH 7.5, 750 mM NaCl, 5% NP-40, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 10% Glycerol.

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【06】 コントロールはそれぞれのサンプルと共に作る必要がありますか? アッセイに対し1つで良いですか?

GDP と GTPgS のローディングコントロールは、プルダウンアッセイが正しく行われたかを検証するためのアッセイコントロールです。これらのコントロールは、ご自身のサンプルの内在性の低分子量 GTPase 活性とは独立しており、それらは1回のみ作る必要があります。

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