FAQ : セルバイオラボ（Cell Biolabs）社　レンチウイルス発現・パッケージングシステム

レンチウイルスを作製するために必要なものは下記の通りです。

1. 293T 細胞　(CBL 社で取り扱っている 293LTV 細胞株など)
2. レンチウイルス発現ベクターにインサート遺伝子を挿入したもの
3. レンチウイルス構造タンパク質を発現するベクターを含むレンチウイルスパッケージングシステム

ViraSafe™ レンチウイルス発現システムは、下記の方法で安全対策を導入しています。

1. ViraSafe™ レンチウイルス発現システムは、複製可能なレンチウイルス (RCL) が作製される機会を最小限にするよう特異的に設計されています。ViraSafe™ システムは、4つの別々のプラスミドをコトランスフェクトする第三世代レンチウイルスパッケージング技術を使用しています。配列の相同性は 80-85% に減少させており、RCL が作られる機会をさらに低くしています。
2. 実質上、種に関係なく感染する通常の VSV-G 偽型ウイルスに加え、ViraSafe™ エコトロピック発現またはパッケージングシステムを選択することで、エコトロピックレンチウイルスを作製することができます。エコトロピックシステムでパッケージングされたウイルスは、異なるエンベロープタンパク質を持ち、マウスとラット細胞のみに感染します。

レンチウイルス発現システムは、エコトロピック（マウス・ラット細胞のみに感染）またはパントロピック（大部分の細胞タイプに感染）のどちらかを選択します。CBL 社のコンプリート発現システムは、11 の異なる発現ベクターのうち1つ、コントロールベクターと3つのパッケージングベクターが含まれています。

• pRSV-Rev パッケージングベクター
• pCMV-VSVG エンベロープベクター (パントロピック) または pCMV-Eco エンベロープベクター (エコトロピック)
• pCgpV パッケージングベクター（Gag とPol）を発現 

この3つのパッケージングベクターはレンチウイルスパッケージングシステムとして取り扱っております(品番： VPK-205,VPK-206)。すでに、第3世代発現コンストラクトをお持ちのお客様はこちらをご利用ください。

エコトロピック偽型ウイルスは、マウスまたはラット細胞のみに感染します。一方で、パントロピック偽型ウイルスは種に関係なく感染します。エコトロピックウイルスは、ヒト細胞に感染しないので、より安全です。しかし、パントロピックウイルスよりも安定性に欠け、濃縮・精製のための超遠心手法を扱うことができません。

pSMPUW ベクターは低コピープラスミドで、一般的に収率は低いです。最大の収量を得るための提案は下記の通りです。

1. pSMPUW ベクターの大腸菌培養は、10ug/mL となるようカナマイシンを含む培地で行います。
2. 最大のプラスミド収率と質を得るために、Stbl3 コンピテントセル（Life Technologies 社）を使用し、中和液を加える前にアルカリプロテイナーゼ（Promega 社 #A1441 または Sigma社 #P8038）で4-5分間、大腸菌ライセートあたり10ユニットを用い処理することを推奨します。Top10 や DH5a コンピテントセルもプラスミドを単離し、制限酵素で切り出し、リコンビネーションが起こらず正しいサイズであるかを確認すれば使用することができます。
3. セルバイオラボ社ではマキシプレップあたり、24時間、37℃で培養された培養液 500 mL からのペレットを用いています。

プラスミドの増幅には Stbl3 コンピテントセル（Life Technologies 社）の使用を推奨しています。Stbl3 は、ウイルス LTR 配列の間で起こるリコンビネーションを最小限にします。DH5a や Top10 といった他の細胞を使用する場合は、プラスミドのサイズを制限酵素で切り出し、正しいサイズであるか確認してください。

レンチウイルス発現ベクターにインサートをクローニングする場合、ポリアデニル化シグナルを含むべきではありません。ウイルスの 3´LTR は polyA サイトを含んでおり、それゆえに上流のポリアデニル化シグナルの存在が、転写の間にウイルスゲノムの切断を起こします。ウイルスゲノムパッケージングに影響を与え、低いタイターの原因になります。

セルバイオラボ社のレンチウイルスパッケージングと発現ベクターは第3世代であり、第2世代のシステムにおいて使用されていた2つのプラスミドに代わり、3つの別個のプラスミドとして必要なパッケージング要素を供給して使用し（すなわち、ヒトへの感染リスクが少ない）、より安全であるように修飾されています。 第2世代のパッケージングシステムと第3世代の pSMPUW レンチウイルス発現プラスミドと一緒に使用するのは問題ありません。しかしながら、セルバイオラボ社のレンチウイルスパッケージングシステムを使用しない場合は、タイターが下がるかもしれません。

トランスフェクションに用いるトータル DNA 量は、トランスフェクションプロトコルによって決定されます。セルバイオラボ社では、プレートサイズに基づき、ご使用の試薬のプロトコルに従うことを推奨します。

安定細胞株を維持するためのいかなる抗生物質もウイルスのパッケージングの際は避けるべきです。なぜなら、トランスダクションの間に培地が持ち越され、ターゲット細胞にとって毒性を示すかもしれないからです。

VSVG 偽型ウイルスは、-80℃ で約6ヶ月保存できます。各凍結・融解サイクルで活性が約 20-30% 落ちますので、凍結する前に分注することをお奨めします。レンチウイルスストックは、氷上でゆっくり溶解してください。エコトロピックレンチウイルスは、安定ではないので凍結しないでください。

典型的なレンチウイルスのタイターは、1×10^6 TU/mL です。しかしながら、この値に影響を与えるパッケージング細胞、トランスフェクション効率、インサートサイズ及び回収までのインキュベーション時間等の様々な要素が存在します。セルバイオラボ社では、このような多くの要素がタイターに寄与しており研究者に依存しておりますので、タイターの値を保証することはできません。

下記に高タイターのレンチウイルスの産生について、いくつかの提案を示します。

1. レンチウイルスは LTR リピート配列を含んでおり、形質転換後リコンビネーションが起こり、プラスミドのサイズが減少する可能性があります。セルバイオラボ社ではリコンビネーションを最小限にするためにプラスミドの増幅に、Life　Technologies 社の Stbl3 コンピテントセルの使用を推奨しております。もしこのコンピテントセルを利用できず、プラスミドを増幅する場合は、プラスミドが正しいサイズを維持しているかを制限酵素で切断して確認する必要があります。
2. インサートは、発現ベクターのクローニングキャパシティーを越えないようにしてください。ウイルスのパッケージングは、長いインサートで効率が落ちます。最大限に近いインサートを挿入した場合、低いタイターとなることが予測されます。
3. トランスフェクション条件は、少なくともトランスフェクション効率が 80% に達するように最適化しなければなりません。80% 以下ではタイターは低くなるでしょう。
4. VSVG 偽型ウイルスとは違って、エコトロピックウイルスは安定ではなく、超遠心や凍結融解サイクルをすることができません。エコトロピックウイルスを作製する場合は、上清から回収後、直ちにターゲット細胞に感染させるのが良いでしょう。 
5. 健康で継代数の少ない 293T 細胞をパッケージングに用いてください。