FAQ : セルバイオラボ（Cell Biolabs）社　細胞浸潤アッセイ

細胞浸潤の研究を始めたばかりの初期段階で条件の最適化を検討中でしたら、24ウェルのフォーマットをお勧めします。条件の最適化を行った後に96ウェルのフォーマットを使用するのが良いでしょう。

これらの製品は細胞遊走と細胞浸潤というそれぞれ異なった過程をアッセイします。 #CBA-101-COLは、固定化された細胞外マトリックスタンパク質のハプトタキシス(走触性)を測定するために設計されています。 #CBA-111-COLは、細胞遊走、細胞外マトリックス分解、タンパク質分解、そして隣接している組織に細胞外マトリックスを通しての細胞の動きといった、複合した過程の細胞浸潤を測定するために設計されています。このアッセイにおいて細胞は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMPs)のようなプロテイナーゼ活性を示し、膜の上部にコートされた基質を分解し浸潤するために必要です。

Boydenチャンバーアッセイに使用するメンブレンのポアサイズは能動的な細胞移動が起きないように、必ず細胞の直径よりも小さなものを選んでください。細胞はアクチン/ミオシン細胞骨格構造を再構築し、先端を伸長することでメンブレンのポアを通過してしまいます。細胞剥離溶液を加え、30分間インキュベーションする上では問題ありません。

24ウェルのフォーマットしかご用意しておりません。残念ながら比色検出の96ウェルのフォーマットでは十分な感度がありません。

多くの細胞浸潤の研究ではインサート上に基底膜成分がコートされたものを使用します。コラーゲンゲルまたはラミニンゲルがコートされたものは、これら特定のECMタンパク質が介在する浸潤に関心のある場合に用いられます。

血清は様々なサイトカインや成長因子を含むため、細胞遊走や細胞浸潤アッセイにおいて化学誘引物質として使用します。細胞を無血清培地に再懸濁することで、チャンバーの上部の細胞とチャンバー底部の10%血清の間に誘引物質の勾配ができます。そのため、細胞のゲル層への浸潤が誘引されます。

血清は様々なサイトカインや成長因子を含むため、通常、がん細胞株などの場合、アッセイ前に細胞を飢餓状態にしておく研究者もいます。飢餓状態の細胞は誘引物質に対する反応が向上します。細胞が飢餓状態になるようにオーバーナイトで処理するのは必須ではなく代わりに、アッセイ前に細胞を無血清培地に再懸濁することが可能です。

基底膜浸潤アッセイのインサートはマトリゲルと同様のECMゲルでコートされています。ECMの抽出物はマウスのEngelbreth-Holm-Swarm(EHS)肉腫由来です。ラミニンを含むコラーゲン?やヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンが主な構成物質として含まれています。

蛍光アッセイの方が比色アッセイよりもより感度が良いです。しかし、比色アッセイは抽出ステップの前に、染色ステップに続いて手作業で細胞をカウントすることができます。手作業でのカウントは、蛍光アッセイを含むどんな検出アッセイよりも感度がよいものになります。

CBL社の浸潤アッセイキットは、細胞の生死に関係なく、固定し染色する染色液を使用します。この染色は、水による洗浄では消えませんが、キット中の抽出溶液には簡単に溶けます。抽出された溶液は、560nmのELISAリーダーで読み取って下さい。

ECM 浸潤チャンバープレートは、12個のインサートを含む24ウェルプレートです。これらのインサートは、取り外すことができ、使用しないインサートは4℃で保存することができます。

HT-1080が使用できない場合、MDA-231が浸潤アッセイのポジティブコントロールとして使用できます。

インサートの染色後、非特異的染色は綿棒を使用して除きます。水で湿らせた綿棒をつぶし、先を平らにします。これをすることによって、綿棒がインサートに近づくことを可能にします。もし、抽出をすでに行った場合は、細胞がインサートの底に付着しているので、インサートをもう一度染色します。もし、染色による問題が解決されない場合は、細胞は手作業でカウントします。

24ウェル浸潤アッセイのインサートは再使用できません。インサートは、ECMタンパク質がコートされているため、アッセイ後には無傷ではありません。このキットは12個のインサートが含まれておりますので、使用しないインサートは4℃で保存して下さい。

はい。これは正常な結果です。遊走アッセイにおいて、大部分の細胞が染色後均一に分布します。浸潤アッセイは異なっており、細胞はECM層を通り抜けなくてはなりません。いくつかの悪性細胞がこの層を分解し穴をあけ、他の細胞が通り抜けるのを可能にします。

細胞は剥離ステップでは生きており、細胞は剥離溶液中で分注し、細胞の生存を測定するのに用いることができます。しかし、細胞はこのステップでは生きていますが、浸潤した細胞が少ないため、感度の低い血球計で生存率を測定するのは困難です。血球系で1細胞が観察できるのは、10,000細胞/mlに等しいです。遊走と浸潤アッセイはたった5-10%の細胞が遊走されると予測されます。アッセイに使用する細胞の最大量は、300,000細胞で、10%の細胞が遊走したとすると、アッセイあたり30.000細胞しか得ることができません。

アッセイする前に、細胞を血清フリーの培地に懸濁して下さい。細胞はこの培地で培養する必要はありません。

はい。96ウェル浸潤アッセイは1回で使い切って下さい。コートされたインサートは1枚のプレートで、たとえ使用しないウェルがあったとしても、37℃、オーバーナイトで浸潤アッセイのインキュベーションにさらされます。使用していないウェルのECM層は、長時間の湿度のある環境下でのインキュベーションにより不安定になり、再使用はできません。CBL社の96ウェルアッセイは、ハイスループット用にデザインされています。

浸潤アッセイにおいて、血清中のBSAを含むのは必須ではありません。ただし、CaCl₂とMgCl₂は、細胞の接着の要因であるインテグリンレセプターの活性化に必要なため重要です。大部分の培地は、CaCl₂やMgCl₂を含んでいますが、もしご自身の培地が含まれていないようであれば添加する必要があります。