FAQ : セルバイオラボ（Cell Biolabs）社　ORAC ＆ HORAC 活性測定キット

3つのアッセイは、抗酸化能を測定するものですが、わずかに異なっています。ORAC と HORAC アッセイは、両方とも蛍光アッセイで、HAT 化合物が蛍光プローブの酸化検出のために使用されます。これら二つのアッセイの主な違いは、プローブの酸化によって生産されたフリーラジカルです。ORAC アッセイはペルオキシルラジカルを生産するためのフリーラジカル開始剤を使用していますが、HORAC はヒドロキシラジカル開始剤を使用しており、フェントン試薬がヒドロキシラジカルの生産をします。(HORAC = hydroxyl radical antioxidant capacity, ORAC = oxygen radical antioxidant capacity).　TAC アッセイは、ORAC や HORAC とは異なる試薬を用いた比色アッセイで、特に、抗酸化による銅の還元反応を基にした、SET メカニズムです。ORAC と HORAC アッセイは、TAC アッセイよりもより感度が良いですが、プロトコルとデータ解析により技術が要求されます。これらのアッセイの選択は、研究に適用できるアッセイの方法　(例：SET vs. HAT)　または、フリーラジカルの生産　(例：ヒドロキシ vs. ペルオキシ)　に依存します。ペルオキシラジカルがヒドロキシラジカルよりも、より関連性があるため、研究者は HORAC より ORAC を好む傾向にあります

一般的に -80℃ で2ヶ月が抗酸化サンプルを保存することが可能な最長期間です。しかし、Cell Biolabs（セルバイオラボ／CBL）社では最も良い結果を得るために、新鮮なサンプルでテストすることをお奨めしています。

ORAC 活性アッセイは、植物サンプルに適合します。植物サンプルは、製品マニュアルの組織ライセート調製ガイドラインに従って調製することが可能です。組織サンプルは、氷冷した PBS でソニケーションまたはホモジネーションし、10,000×g、10分間、4℃で遠心分離します。上清は、小分けにして保存し、アッセイに使用して下さい。サンプルが植物や食品などで多くの抗酸化物質を含んでいる場合、親水性、親油性の画分どちらかに溶ける抗酸化物質があるかもしれないので、両方の画分を調製することをお奨めします。

尿サンプルはORAC アッセイに使用できます。尿中の抗酸化能力は低く、希釈せずに測定してみて下さい。

ORAC アッセイは、細胞培養上清を含む様々なサンプルタイプの抗酸化能を検出することが可能です。培地自身がアッセイを干渉しないかを確認するために、培地のみのコントロールを使用し、バックグランドを確認して下さい。

サンプル調製は、サンプルの持っている溶解性に基づいています。サンプルが、植物や食品のように多くの抗酸化物質を含んでいる場合、親水性・親油性両方の画分を調製して下さい。

その理由はサンプル調製にあり、抗酸化物質の濃度ではありません。血清を回収するには、1つの方法しかなく、血清タンパク質が濃縮され、それゆえに希釈することによって上手く測定できます。組織ライセートは、複数の調製方法があり、タンパク質の濃縮は変化します。ライセートプロトコルには変化する点がいくつもあり、全てのケースにおいて希釈を推奨していません。ライセートの場合、最初は希釈せずに測定し、その後必要であれば、アッセイ希釈液で希釈して調節して下さい。

サンプル調製は、ご自身の粉末サンプルの溶解度に依存します。親水性の画分は、キットに含まれるアッセイ希釈液を使用し希釈して下さい。親油性の画分は、100%アセトンに溶解し、50%アセトンで希釈します。1時間、室温で撹拌しながらインキュベーションします。両方の画分において最滴な希釈率を決定するためのテストが必要です。

エタノールなどの別の溶媒の使用し、粉末サンプルを溶解することをお奨めします。他の溶媒としては、メタノール、クロロホルム、ヘキサンが挙げられますが、ご自身でサンプルに合わせた適切な溶媒を選択して下さい。もしサンプルがとても親油性ですぐに溶けない場合、さらに希釈し、加熱し溶かすことが必要かもしれません。

抗酸化物質がなく、フリーラジカルが AAPH によって生産されている場合、蛍光プローブにアタックし、結果として、シグナルの減少が起こります。抗酸化物質の存在によって、AAPH によって生産されたフリーラジカルは、消光し、結果としてプローブにアタックする有効ラジカルが少なくなります。蛍光は、抗酸化物質の存在しないサンプルに比べ、抗酸化物質を含むサンプルはゆっくりした比率で下がります。