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HEK-Blue™ hTLR9細胞は、Toll-like receptor 9(TLR9)依存性NF-κBパスウェイを研究するために作製されたHEK293細胞株由来の細胞株です。この重要なパターン認識受容体（PRR）は、微生物または宿主由来の自己DNAの特徴であるメチル化されていないCpGジヌクレオチドを認識し、その後NF-κBおよびIRF免疫応答を誘発します[1]。
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背景
図1 HEK-Blue™ hTLR9細胞のシグナル伝達図
HEK-Blue™ hTLR9細胞は、ヒトTLR9遺伝子の安定した発現と、SEAP(分泌型胚性アルカリホスファターゼ)の誘導性レポーター遺伝子を特徴としています。TLR9の刺激時に生成されるSEAPレベルは、SEAPのリアルタイム検出を可能にする細胞培養培地であるHEK-Blue™ Detectionでアッセイを行うことで容易に測定できます。または、SEAP検出試薬であるQUANTI-Blue™を使用してSEAP活性をモニターすることもできます。
HEK-Blue™ hTLR9細胞は、CpG モチーフを含むオリゴヌクレオチド (CpG ODN
) などの TLR9 アゴニストに対して高い応答性を示します。親細胞株であるHEK-Blue™ Null1と比較して、クラス A (例: ODN 2216)、クラス B (例: ODN 2006)、クラス C (例: ODN 2395) の CpG-ODN をインキュベートすることで強力なNF-κB応答を示します(図1)。
TLR9 は NF-κB と IRF の両方のシグナル伝達経路を活性化するため、InvivoGen社 では、NF-κB 誘導性 SEAP と IRF 誘導性 Lucia ルシフェラーゼを含むデュアル レポーター システムを発現する細胞株である HEK-Dual™ hTLR9 細胞も提供しています (詳細はこちら)。
尚、HEK293 細胞は、TLR3、TLR5、RIG-I 様受容体などのさまざまな PRR を内因性レベルで発現しており、そのためそれらの同族リガンドに反応する可能性があります
(図1)。
特長
- ヒトTLR9の安定発現
- CpGモチーフを含む合成DNAに対する高い反応性
- SEAP活性の評価によるTLR9依存性NF-κB活性化のモニタリング
アプリケーション
- TLR9依存性NF-κBシグナル伝達経路の役割の定義
- 親細胞株HEK-Blue™ Null1との比較による新規TLR9アゴニストおよび阻害剤のスクリーニング
- HEK-Blue™ mTLR9細胞を用いた場合のヒトとマウスのTLR9の差異性の研究
参考文献
- Kumagai Y. et al., 2008. TLR9 as a key receptor of the recognition of DNA. Adv. Drug. Deliv. Rev. 60(7):795–804.
商品データ
HEK-Blue™由来細胞のTLR9アゴニストに対する応答
HEK-Blue™ Null1、HEK-Blue™ hTLR9細胞をHEK-Blue™検出試薬で培養し、10 mMのTLR9アゴニスト(ODN 2216、ODN 1826、ODN 2006、ODN 2395)で24時間刺激した。ヒトTNF-α(1ng/mL)はNF-κBのポジティブコントロール。24時間のインキュベーション後、上清中のSEAPレベルを測定することにより、NF-κB誘導性SEAP活性を評価した。データは650 nmにおける吸光度(OD)として示した(平均値±SEM)。
TLR9アゴニストに対するHEK-Blue™hTLR9細胞の用量反応
細胞をHEK-Blue™検出試薬で培養し、ODN 2216, ODN 1826, ODN 2006, ODN 2395の濃度を増加させて刺激した。24時間培養後、NF κB誘導SEAP活性をODを650 nmで測定した(平均値±SEM)。
様々なPRRアゴニスト及びサイトカインに対するHEK-Blue™ hTLR9細胞の応答
細胞をHEK-Blue™検出試薬で培養し、サイトカイン及び種々のPRRアゴニスト:ヒトTNF-α(NF-κBのポジティブコントロール、1 ng/mL)、Pam3CSK4(TLR2リガンド、100 ng/mL)、poly(I:C)HMW(TLR3リガンド、100 ng/mL)、LPS-EK UP(TLR4リガンド、100 ng/mL)、CRX-527(合成TLR4リガンド、10 ng/mL)、FLA-ST UP(TLR5リガンド、10 ng/mL)、R848(TLR7/8リガンド、10µg/mL)、ODN2006(TLR9リガンド、10µg/mL)、Tri-DAP(NOD1リガンド、10µg/mL)及びMDP(NOD2リガンド、10µg/mL)で24時間刺激した。24時間のインキュベーション後、上清中のSEAPレベルを測定することにより、NF-κB誘導性SEAP活性を評価した。データは650 nmにおける吸光度(OD)として示した(平均値±SEM)。
HEK-Blue™ hTLR9とHEK-Dual™ hTLR9のNF-κB応答
HEK-Blue™ hTLR9細胞およびHEK-Dual™ hTLR9細胞を、様々なTLR9アゴニストとサイトカイン： TNF-α(10ng/mL)、ODN2216(クラスA、ヒトTLR9が望ましい、10µM)、ODN1826(クラスB、マウスTLR9が望ましい、10µM)、ODN2006(クラスB、ヒトTLR9が望ましい、1µM)又はODN2395(クラスC、ヒト/マウスTLR9が望ましい、10µM)。一晩インキュベートした後、QUANTI Blue™溶液を用いて上清中のSEAP活性を測定することにより、NF-κBの活性化を評価した。データは650 nmにおける吸光度(OD)として示した(平均値±SEM)。
仕様
- 抗生物質耐性：Blasticidin, Zeocin®
- 増殖培地： DMEM, 4.5 g/l glucose, 2 mM L-glutamine, 10% (v/v) fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 100 µg/ml Normocin™
構成内容
- 3-7 x 106 cells
- Blasticidin (10 mg/ml):1 mL
- Zeocin® (100 mg/ml):1 mL
- Normocin™ (50 mg/ml):1 mL
- HEK-Blue™ Detection (cell culture medium for real-time detection of SEAP)
| 品名 | メーカー | 品番 | 包装 | 希望販売価格 |
|---|---|---|---|---|
HEK-BlueTM hTLR9 cells |
ING | HKB-HTLR9 | 1 VIAL [3-7 x 10e6 cells] |
￥376,000 |
【関連商品】
| 品名 | メーカー | 品番 | 包装 | 希望販売価格 |
|---|---|---|---|---|
| HEK-BlueTM Null1 cells |
ING | HKB-NULL1 | 1 VIAL [3-7 x 10e6 cells] |
￥315,000 |
| HEK-Blue-LuciaTM hTLR9 |
ING | HKD-HTLR9NI | 1 VIAL [3-7 x 10e6 cells] |
￥376,000 |
背景
Toll-Like Receptor 9 (TLR9)とは？
Toll-Like Receptor 9 (TLR9)は、非メチル化シトシン-ホスホロチオエート-グアノシン(CpG)形態のDNAを認識すると、NF-κBおよびIRFを介した炎症誘発性反応を引き起こすエンドソーム受容体です[1-3]。非メチル化CpGジヌクレオチドは、微生物(細菌、ウイルス、真菌、寄生虫)DNA、およびミトコンドリア自己DNAの特徴です[3,4]。これらのTLR9アゴニストは、CpGモチーフを含む合成オリゴヌクレオチド（CpG ODN）によって模倣することができ、ワクチン接種における適応免疫応答を改善するために広く研究されてきました[1,3]。
TLR9は、主に樹状細胞のサブセットとすべての哺乳類のB細胞で発現しています。げっ歯類では、TLR9は単球やマクロファージでも発現しています[3]。受容体の構造は、ヒトTLR9(hTLR9)とマウスTLR9(mTLR9)で24%異なります[3]。それらは異なるCpGモチーフを認識し、最適な配列はhTLR9ではGTCGTT、mTLR9ではGACGTTと報告されています。[5]
CpG ODNとは？
ODN 1018などの非メチル化CpGモチーフ(CpG ODN)を含む合成オリゴデオキシヌクレオチドは、アジュバントとして広く研究されています[6]。これらのCpGモチーフは、細菌DNAでは哺乳類DNAと比較して20倍高い頻度で存在します。[7]CpG ODNはTLR9によって認識され、TLR9はヒトB細胞および形質細胞様樹状細胞(pDC)上に発現し、それによってTh1優位の免疫応答を誘導します。[8]げっ歯類やヒト以外の霊長類で実施された前臨床試験やヒト臨床試験では、CpG ODNがワクチン特異的抗体反応を大幅に改善できることが実証されています[6]。A型、B型、C型の3種類の刺激性CpG ODNが同定されており、それぞれ免疫刺激活性が異なります[9]。
参考文献
- Kumagai Y. et al., 2008. TLR9 as a key receptor of the recognition of DNA. Adv. Drug. Deliv. Rev. 60(7):795-804.
- Heinz L.X. et al., 2021. TASL is the SLC15A4-associated adaptor for IRF5 activation by TLR7-9. Nature. 581(7808):316-322.
- Kayraklioglu N. et al., 2021. CpG oligonucleotides as vaccine adjuvants. DNA Vaccines: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Vol. 2197. p51-77.
- Kumar V., 2021. The trinity of cGAS, TLR9, and ALRs: guardians of the cellular galaxy against host-derived self-DNA. Front. Immunol. 11:624597.
- Bauer S. et al., 2001. Human TLR9 confers responsiveness to bacterial DNA via species-specific CpG motif recognition. Proc Natl Acad Sci USA, 98(16):9237-42.
- Steinhagen F. et al., 2011. TLR-based immune adjuvants. Vaccine 29(17):3341-55.
- Hemmi H. et al., 2000. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 408:740-5.
- Coffman RL. et al., 2010. Vaccine adjuvants: Putting innate immunity to work. Immunity 33(4):492-503.
- Krug A. et al., 2001. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN-alpha/beta in plasmacytoid dendritic cells. Eur J Immunol, 31(7): 2154-63.
商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。
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