記事ID ： 44010

3種類のアッセイをご用意 Echelon社ヒアルロン酸アッセイ

メーカー名：Echelon Biosciences Inc.

ヒアルロン酸（HA）は、高分子量（1,000-10,000kDa）の陰イオン性多糖で、グルクロン酸とアセチルグルコサミンの二糖の繰り返しで構成されています。Echelon(ECL)社では異なる原理でHAを測定するキットを用意しています。では、

どのヒアルロン酸アッセイを使用したらよいか？
答えは...お客様のサンプルによります。ECL社が提供する3種類のヒアルロン酸（HA）アッセイはすべて、低い変動係数（CV）、高感度検出、使いやすいデザインを備えた高品質のアッセイです。下図は、各HA検出アッセイのフォーマットを示したものです。これらのアッセイはそれぞれ、特定のサンプルタイプに適したユニークな特性を持っています。

HAは多くの臓器や組織で生成される多機能グリコサミノグリカンで、その濃度とサイズは様々です（表1）。ECL社のHAアッセイは、さまざまな研究課題に対応するために開発されました。ECL社ではお客様からご自身の研究に適したアッセイの選択についてよくお問い合わせをいただきます。そこで、各HAアッセイの最適なアプリケーションを解剖してみたいと思います。この記事が、次回のHA実験に適切なアッセイを選択するための一助となることを願っています。

表1. 生体試料におけるHAの濃度と分子量分布¹⁾

表2. ECL社HAアッセイ比較表

	競合法ELISA	サンドウィッチELISA	Alpha Screen™※
品番	K-1200	K-4800	K-5800
キット中の全ウェル数	96 well		500 well
アプリケーション	細胞上清および血清サンプルを含む生物由来サンプル中のHA濃度測定		生物由来サンプルから精製したHAの濃度測定
アッセイ時間	2.5～3時間	2.5～3時間	1.5時間
インキュベーション湿度	4℃、37℃ & RT	RT	RT
HAスタンダード	複数の分子量からなる精製されたHA
検出するHAの分子量	全ての分子量	> 130 kDa	全ての分子量
HAの検出範囲	50～1,600 ng/ml	12.5～3,200 ng/ml	1.56～1,600 ng/ml
HAの検出限界	40 ng/ml	5 ng/ml	20 ng/ml
必要サンプル量 [2連(duplicate)]）	100～200 µl	25 µl	10 µl
Intra & Inter Assay CVs	＜ 20% Intra CV ＜ 10% Inter CV	＜ 5% Intra CV ＜ 20% Inter CV	N/A

※ 本製品は、AlphaScreen™テクノロジーを利用した製品であり、AlphaScreen™ Histidine (Nickel Chelate) Detection Kit(PerkinElmer cat#6760619C, M or R) と、AlphaScreen™シグナルの検出が可能なマイクロプレートリーダーを別途ご用意ください。

参考文献

Cowman, M. K.; Lee, H. G.; Schwertfeger, K. L.; McCarthy, J. B.; Turley, E. A., The Content and Size of Hyaluronan in Biological Fluids and Tissues. Front Immunol 2015, 6, 261.

Hyaluronan ELISA (品番:K-1200)

図1

HA ELISA は競合法を採用しています。サンプル中の HA は検出プレート上にコートされた HAに競合するので比色シグナルはサンプル中に存在するHAの量に反比例します。このアッセイは過去15年間、HA研究コミュニティで広く使われており、血清、尿、滑液、細胞培養液など様々な種類のサンプルに焦点を当てた論文が発表されています。このアッセイでは、サンプル量 0.1 mL 中に存在する 40 ng/mL という低濃度のあらゆるサイズのHAを検出することが可能です。

Best For:広いMW範囲の HAを含むサンプル

Hyaluronic Acid Sandwich ELISA (品番:K-4800)

図2

HAサンドイッチELISAは、その名が示すように、2層のHA抗体の間でHA濃度を測定します。サンプル中のHAは、まずプレート上にコーティングされたHAキャプチャー抗体によって捕捉され、次に標識されたHA抗体によって検出されます。このサンドイッチアッセイ方式は、より高いアッセイ感度を提供します。ポリマーとしてのHAの物理的特性（複数の結合部位）により、サンドイッチELISA は HA のサイズにセンシティブです。このアッセイは、サンプル量 10 µL中に存在する 130 kDa以上の分子量を持つ、5 ng/mL という低濃度のHAを検出することが可能です。(アッセイに使用するサンプル量は、n=2 の場合、サンプル希釈するため、多めにサンプル液25 µL を使用します。)

Best For:低濃度で130 kDaを超える狭い MW範囲の HAを含むサンプル

Hyaluronic Acid Alpha Screen™ Assay (品番:K-5800)

図3

HA AlpahScreen アッセイは、競合するレーザー励起のビーズベースのアッセイです。サンプルに存在する HA は、アクセプタービーズに結合した His タグ HA 抗体とドナービーズに結合したビオチン-HA との結合に競合します。ドナービーズとアクセプタービーズが 200 nm 以内にある場合にシグナルが生成されます。したがって、ビオチン-HA/HA 検出抗体の相互作用がサンプル中に存在する HA によって中断されると、シグナルは生成されなくなります。レーザー励起のビーズベースの本アッセイは、アッセイ感度を大幅に向上させ、洗浄ステップをなくすことでアッセイ時間がわずか 90 分と短縮されています。また、サンプル量がわずか 5 μL中に存在する 20 ng/mL という低濃度の HA のすべてのサイズを検出することが可能です。(アッセイに使用するサンプルは、5µl/wellです。n=2の場合、最小10µl/assayのサンプル量で測定できます。)

Best For:限られたサンプル量で、低濃度や広い MW範囲のHAを含むサンプル

Echelon社ヒアルロン酸アッセイ

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
Hyaluronan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (HA ELISA)	ECL	K-1200	1 KIT	￥168,000
Hyaluronic Acid Sandwich ELISA	ECL	K-4800	1 KIT	￥177,500
Hyaluronic Acid AlphaScreen Assay	ECL	K-5800	1 KIT	￥181,000