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記事ID : 34506
研究用

細胞内で標的タンパク質とサンプルの結合を熱安定化により評価Eurofins DiscoverX 社 InCELL Pulse™ Target Engagement Assays
細胞内で標的タンパク質とサンプルの結合を熱安定化により評価

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背景

創薬研究において、サンプルと標的タンパク質の結合を確認することは非常に重要です。結合評価系として一般的な細胞を使用しない SPR や ITC は、サンプルの膜透過性を反映していない・標的タンパク質の構造が細胞や生体内と異なるため、その他のアッセイと結果が相関しない場合がある等の問題を抱えていました。

Eurofins DiscoverX 社の InCELL Pulseアッセイは、特定の物質が結合した際に誘導されるタンパク質の熱安定化を応用することで、サンプルと標的タンパク質の結合をセルベースで評価可能です。

特長

  • 細胞内でサンプルと標的タンパク質の結合を評価 (Fig.1)
  • 化学発光系によるHTS対応、簡便なプロトコル
  • 任意のタンパク質評価用細胞株構築用の空ベクターでのご提供
  • 結合部位に依存せず標的タンパク質とサンプルの結合を評価可能 (Fig.3)
  • 様々なタンパク質の評価実績 (Table.1)

原理

アッセイ原理
Fig.1 InCELL Pulse Target Engagement Assayの原理
本アッセイでは、サンプルが結合した際に誘導されるタンパク質の熱安定化を利用し、熱変性後のタンパク質量の変化を指標にサンプルとタンパク質の相互作用を検出する。

(A) ePLタグ(βガラクトシダーゼの断片)でタグ付けした標的タンパク質を強制発現する細胞株を構築し、この細胞株にサンプルを添加後、熱変性処理をする。
(B) サンプルが標的タンパク質に結合した場合には標的タンパク質の熱安定性が向上し、熱変性後も安定な状態で保持される。この状態の細胞の lysate に、ePLタグに相補的なβガラクトシダーゼの断片 (EA) と基質を加えることでシグナルを検出する。
(C) サンプルを添加しない場合、または標的タンパク質とサンプルが結合しない場合は (B) で見られた熱安定化が起こらず、熱変性により失活する。その結果活性をもった標的タンパク質が減少し、最終的に得られるシグナルも低下する。(B) と (C) で得られるシグナルを比較することで、セルベースでサンプルと標的タンパク質の結合を評価する。

MTH1 Hydrolaseの評価データ

Fig.2 MTH1 Hydrolaseの評価データ

DRX_incell-pulse-target-engagement_3.jpg

Fig.3 結合部位の異なるサンプルの評価データ
(A) タイプ1、タイプ2キナーゼ阻害剤の結合を評価
(B) アロステリック阻害剤の結合を評価

Table. 1 評価済みターゲットの一覧
Kinase Target Class
ABL1 FAK Tyr Kinase
ABL1(T315I) IGF1R
ACVR1 JAK2(JH1)
BTK1 KIT
AAK1 GAK Ser/Thr Kinase
AKT1 HASPIN
AURK! MEK1
BRAF p38-alpha
BUB1 PAK4
CAMK2A PKAC-alpha
CSNK2A2 PLK1
ERK1 SRPK1
VPS34 Lipid Kinase
MTH1 Hydrolase
G9a Methyltransferase

ご利用方法

InCELL Pulse™ Target Engagement Starter Kit

ePLタグ付けした任意のタンパク質を発現する細胞株構築用の、空ベクターを含むキットになります。ご希望のターゲットを発現させた細胞株の構築が可能です。

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