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研究用

E3 ligaseとの結合評価系及びセルベースの標的タンパク質分解検出系構築サービスEurofins DiscoverX社PROTAC関連サービス

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PROTAC(proteolysis-targeting chimeras)は、これまで創薬標的にならないとされていたタンパク質を標的とした創薬へのアプローチが可能であることから、新たなモダリティとして近年注目されています。PROTACの研究開発では、E3 ligaseに対する化合物の結合評価や標的タンパク質の分解の評価が必須となります。

Eurofins社では、化合物のE3 ligaseに対する結合評価サービス(E3scan)と、セルベースの標的タンパク質分解検出系の構築サービスにより、PROTAC研究を複数の角度からサポートいたします。

E3scan:E3 ligaseと化合物の結合評価系

【特長】

  • 多様なE3 ligaseに対応
    (MDM2, CRBN with DDB1, VHL with Elongin B/C, cIAP1, cIAP2, XIAP, MDMX)*
  • 全ターゲットを共通のプラットフォームで評価可能(Fig.1)
  • 既知の阻害剤やPROTACでバリデーション済み(Fig.2, Fig.3)
  • 短納期(サンプルがメーカーに到着後約2週間で結果送付)
*新規ターゲットは随時追加予定です。

【原理】

E3scanの原理

Fig.1 E3scanの原理
(Panel A)DNAタグが付加されたE3 ligaseは、固相化されたリガンドに結合します。(Panel B)化合物がE3 ligaseとリガンドの間の結合を競合阻害する場合、E3 ligaseはリガンドから解離し、リガンドに結合したE3 ligaseの量が減少します。(Panel C)競合阻害しない場合は、E3 ligaseはリガンドに結合したままとなり、E3 ligaseの量は減少しません。(Panel D)DNAタグをqPCRにより検出し、リガンドに結合したE3 ligaseの量を検出することで、化合物のE3 ligaseに対する結合を評価します。

【データ例】

CRBNに対する結合評価データ

Fig.2 CRBNに対する結合評価データ
既知の阻害剤(Lenalidomide)及びPROTAC(ARV-825, BSJ-04-132)のCRBNに対する結合を確認した。

MDM2に対する結合評価データ

Fig.3 MDM2に対する結合評価データ
AILERON社のstapled peptideのMDM2に対する結合を確認した。ATSP-7041はBiacoreで得られたKd値(0.91 nM)に近い値を示した。

セルベースの標的タンパク質分解検出系

【特長】

  • ご希望のタンパク質の分解検出用細胞株を構築
  • 標的タンパク質は過剰発現せずアッセイが可能(Fig.4, Fig.5)
  • HTSにも対応可能な簡便なアッセイ系
  • 既存のPROTACの標的タンパク質でのアプリケーション実績(Fig.6)

【原理】

アッセイ用細胞構築の流れ

Fig.4 アッセイ用細胞構築の流れ
本サービスでは、CRISPR-Cas9を使用して、標的タンパク質にメーカー独自のEDタグを付加するようゲノム編集を行い、アッセイ用細胞株を構築する。

標的タンパク質の分解の検出原理

Fig.5 標的タンパク質の分解の検出原理
標的タンパク質が分解されていない定常条件下では、EDタグを介した標的タンパク質の検出系(EFC)によりシグナルが得られる。PROTACを加えることで標的タンパク質がE3 ligaseにリクルートされ、ユビキチン-プロテアソーム系を介して分解されるため、EDタグを介したシグナルが低下する。

【データ例】

BRD4と下流のc-Mycの分解アッセイデータ

Fig.6 BRD4と下流のc-Mycの分解アッセイデータ
(左図)BRD4に対するPROTAC(MZ1, dBET1, ARV-825)はBRD4の分解を誘導したが、BRD4阻害剤(JQ1, OTX015)は分解誘導しなかった。
(右図)BRD4に対するPROTACの一部(MZ1, ARV-825)は、長時間incubationすることでBRD4の下流のc-Mycの量も減少させた。

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