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LSAB法に基づくFFPE切片染色用試薬 ImmunoCruz™ LSAB Staining System

メーカー名：Santa Cruz Biotechnology, Inc.

ImmunoCruz™ LSAB Staining Systemは、HRP-ストレプトアビジン複合体を応用したLSAB（Labeled StreptAvidin Biotin）法に基づくシステムです。ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片染色にご使用いただけます。

ImmunoCruz LSAB Staining System

構成内容

ペルオキシダーゼブロック
血清ブロック剤（正常マウス血清）
ビオチン化二次抗体
HRP標識アビジンD
※上記試薬は希釈済みで、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の免疫組織化学染色に即使用可能です。
50x ペルオキシダーゼ基質
50x DAB色原体
15x 基質バッファー

＊スライド150枚分
＊ネガティブコントロール（IgG）と一次抗体はご用意いただく必要があります。一次抗体は力価をご検討のうえ、付属の血清ブロック剤で0.5～5 µg/mLに希釈してください。

使用方法

95%エタノールでガラススライドをきれいにし、下塗り剤で処理してから風乾します。もしくは、前処理されたスライドをご使用ください。
組織切片を4～6ミクロンに薄切し、スライドにのせます。その後、キシレンで脱パラフィンします (各5分間3回交換)。段階的な濃度のアルコール (100% エタノールで10分間を2回、95% エタノールで10分間を2回にて洗浄) を使い、徐々に切片を水和します。撹拌しながら1分間、イオン交換水で洗浄し、その後スライド上の余分な液を吸引します。
オプション：熱処理により抗原をアンマスクするには、スライドを容器に入れて、10 mMクエン酸ナトリウム, pH 6.0もしくは、0.01% (w/v) EDTAを含む50 mMグリシン-HClバッファーでカバーし、95℃で5分間加熱します。そして、新鮮なバッファーで95℃、5分間さらに加熱します(組織の種類により、インキュベーション時間が異なりますのでご注意ください)。約20分バッファーでスライドを冷やします。そしてイオン交換水で3回 (各2分間) 洗浄し、スライド上の過剰な液を吸引します。
下記の作業はすべて室温で加湿された環境にて行ってください。使用前に本システムの試薬すべてを室温に戻します。作業中は標本が乾燥しないようにご注意ください。
オプション：内因性ペルオキシダーゼ活性を失活させるには、標本に1～3滴のペルオキシダーゼブロック剤を滴加して5分間インキュベートします。PBSで濯ぎ、スターラーでPBSにて2分間洗浄します。スライドの余計な液体を吸引します。
標本に1～3滴の血清ブロック剤を滴下し、20分間インキュベートします。その後、スライドから血清を吸引します。
一次抗体を、力価を決定したうえで0.5～5 µg/mLに希釈します。抗体の希釈駅には付属の血清ブロック剤を用います。組織を覆う十分量の希釈抗体を塗布します。
2時間インキュベートします。PBSで濯ぎ、スターラーでPBSにて2分間2回洗浄します。スライドから余剰の液体を吸引します。
標本を1～3滴のビオチン化二次抗体で30分間インキュベートします。PBSで濯ぎ、スターラーでPBSにて2分間2回洗浄します。スライドから余剰の液体を吸引します。
標本を1～3滴のHRP-ストレプトアビジンで30分間インキュベートします。PBSで濯ぎ、スターラーでPBSにて2分間2回洗浄します。スライドから余剰の液体を吸引します。
インキュベーションの間に、下記に従い基質混和ボトルでHRP基質を調製します（スライド15～20枚分）。混和ボトルからチップを除去し、1.6 mLイオン交換水、5滴の10x 基質バッファー、1滴の50x DAB色原体、1滴の50x ペルオキシダーゼ基質を混和します。
各スライドに1～3滴のHRP基質を滴加します。一般的には30秒～10分間、必要なら20分までの長さで、明褐色の染色が確認できるまで発色させます。イオン交換水で濯いで顕微鏡観察し、染色を確認します。必要に応じてHRP基質を追加しインキュベートを継続します。イオン交換水で濯ぎ、スターラーでイオン交換水にて2分間洗浄します。
オプション：ギル組成#2のヘマトキシリンで5～10秒対比染色します。直ちにイオン交換水で5分間洗浄します。
オプション：酸性アルコールと青味付け剤で脱染色します。水道水で洗浄します。
95%エタノール10秒間2回、100%エタノール10秒間2回、キシレン10秒間3回で脱水します。剰余キシレンを拭き取ります。
直ちに1～2滴の封入剤を滴下し、カバーガラスで覆います。顕微鏡で観察します。