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ABC染色に基づく免疫組織化学検出システム ImmunoCruz™ ABC Staining System

メーカー名：Santa Cruz Biotechnology, Inc.

Santa Cruz Biotechnology社では、免疫組織化学適応用一次抗体の使用を容易にするABC染色システム「ImmunoCruz™ ABC Staining System」を提供しています。Avidin-Biotin-peroxidase Complex を利用して検出を行います。

ImmunoCruz ABC Staining System

構成内容

1.0 mL正常ブロッキング血清
250 µLビオチン化二次抗体
0.5 mLアビジン
0.5 mLビオチン化HRP（AB試薬）
1.0 mL 50x ペルオキシダーゼ基質
1.0 mL 50x DAB色原体
3.0 mL 15x 基質バッファー
試薬調製用混和ボトル

＊ABC染色システム1個で200枚のスライドを染色できます。
＊ガラス蒸留水で調製したPBS、0.1～1%過酸化水素（PBS、蒸留水、またはメタノールで希釈）、一次抗体、固定や脱パラフィン用の試薬、対比染色、封入剤等は別途ご用意ください。

ABC染色システムの試薬調製

ブロッキング血清：混和ボトル1で、30 µL正常ブロッキング血清ストックと2 mL PBSを混和します。
ビオチン化二次抗体：混和ボトル2で、30 µL正常ブロッキング血清ストック、2 mL PBS、20 µLビオチン化二次抗体ストックを混和します。
AB酵素溶液：AB混和ボトルで、40 µL試薬A（アビジン）、40 µL試薬B（ビオチン化HRP）、2 mL PBSを混和します。混和後、約30分間静置します。
ペルオキシダーゼ試薬：基質混和ボトルで、1.7 mL蒸留水、3滴の15x 基質バッファー、1滴の50x DAB色原体、1滴の50xペルオキシダーゼ試薬を混和します。15-20枚のスライドに足りる量です。

注意事項：
新しく調製したバッファー以外は使用しないでください。試薬調製はすべて付属の混和ボトルで行います。調製後、液滴ディスペンサー栓（逆向きで供給）をキャップに正しい向きで挿入します。組み合わせた部品をボトルに乗せ、キャップを捻ると、液滴ディスペンサーがはまります。再充填の際に液滴ディスペンサーを外すには、親指で横向きに押し込みます。蒸発を防ぐために、使用中以外は確実にキャプを閉めてください。染色作業が終了したら、調製した試薬は破棄して混和ボトルは蒸留水で洗浄します。

免疫ペルオキシダーゼ染色の手順

オプション：組織切片の調製後、内因性ペルオキシダーゼ活性を失活させるために、PBS、蒸留水、またはメタノールで希釈した0.1～1%の過酸化水素溶液中で5～10分間インキュベートします。PBSで5分間2回洗浄します。
オプション：切片を1.5%ブロッキング血清PBS溶液中で1時間インキュベートします。この作業は非特異的な染色が問題とならない場合は省略可能です。スライド上の過剰なブロッキング血清は吸い取ってください。
切片を一次抗体で、室温で30分または4℃で一晩インキュベートします。最適な抗体濃度は力価測定により決定してください。推奨範囲は、1.5%ブロッキング血清PBS溶液で希釈した濃度で0.5～5.0 µg/mLです。PBSで5分間3回洗浄します。
切片を、混和ボトル2のように、または約1 µg/mLに調製したビオチン化二次抗体で30分間インキュベートします。PBSで5分間3回洗浄します。
切片をAB酵素試薬で30分間インキュベートします。PBSで5分間3回洗浄します。
切片を1～3滴のペルオキシダーゼ基質（基質混和ボトル）で30秒～10分間、または希望の染色強度が得られるまでインキュベートします。水洗して顕微鏡観察を行い、切片の染色を確認してください。必要に応じて、ペルオキシダーゼ基質を追加してインキュベートを継続します。蒸留水で5分間洗浄します。
オプション：ギル組成#2のヘマトキシリンで5～10秒対比染色します。直ちに蒸留水で5分間洗浄します。
オプション：酸性アルコールと青味付け剤で脱染色します。水道水で洗浄します。
パラフィン包埋組織切片では、95%エタノール10秒間2回、100%エタノール10秒間2回、キシレン10秒間3回で脱水します。剰余キシレンを拭き取ります。
直ちに1～2滴の封入剤を滴下し、カバーガラスで覆います。顕微鏡で観察します。

注意事項：
作業はすべて加湿された室温で行ってください。必要に応じて染色皿、染色壺をご使用ください。切片を完全に覆うのに十分な量、通常100 µLまたは1～3滴の試薬を滴下します。吸引器を用いて試薬を除去しますが、標本の乾燥は避けてください。