CRISPR/Cas9 プラスミドのトランスフェクションに最適 UltraCruz® Transfection Reagent

本製品は、細胞ダメージを最小限に抑え、高い効率でDNAを導入するトランスフェクション試薬です。
shRNA プラスミド、CRISPR/Cas9 KO プラスミド、HDR プラスミド、Cre ベクター、ダブルニッカーゼプラスミド、CRISPR/dCas9 活性化プラスミドでの使用を推奨します。6ウェルプレートで10〜40回分（0.2 mL）の試薬が含まれます。

• 最大20回分（20 µg 精製プラスミドDNAをトランスフェクション）
• 様々な細胞株で高効率なDNAトランスフェクションが可能
  ：CHO-K1、COS、LNCaP、NIH/3T3、293、T24、C2C12、SF-9、初代ヒトケラチノサイト、初代大動脈平滑筋細胞、初代ウサギ筋芽細胞、ヒト骨髄内皮細胞（HBMEC）など
• CRISPR/Cas9 KOプラスミド、HDRプラスミド、Creベクターでの使用に推奨
• 4 ℃保存（禁凍結、遮光）

本プロトコールは、6ウェル組織培養プレートの1ウェル用です。それ以外のウェルやディッシュを使用する場合は、サイズに応じて細胞数や試薬の量を調整してください。

• トランスフェクション 24時間前に、6ウェル組織培養プレートに、1ウェルあたり 1.5 x 10⁵ - 2.0 x 10⁵ 個の細胞を、抗生物質不含の標準的な増殖培地 3mL 中に播種します。細胞を 40-80% コンフルエントに増殖させます。最初に播種する細胞数と、24時間後の細胞密度は、トランスフェクションに使用する細胞の増殖速度に基づいて決定します。CRISPR/Cas9 KO プラスミドトランスフェクションを成功させるには、状態が良く、サブコンフルエントになった細胞が必要となります。
• 次の溶液を調製します。

  注： 最適な「プラスミドDNA：UltraCruz® トランスフェクション試薬」の比率は、プラスミドDNA 1 µg に対して UltraCruz® トランスフェクション試薬 5-15 µL の範囲で予備試験を行い、決定します。トランスフェクション試薬の量を、細胞毒性が最小限になるように最適化し、プラスミドDNA濃度を 1-3 µg／ウェルの範囲で変更することができます。UltraCruz® トランスフェクション試薬の最適な量が 10 µL の場合は、プラスミドDNA濃度は 1-3 µg/10 µL の範囲で試験します（例： プラスミドDNA / UltraCruz® トランスフェクション試薬量： 1 µg/10 µL、2 µg/10 µL、3 µg/10 µL）。プラスミドDNA / UltraCruz® トランスフェクション試薬複合体の適切な量（1ウェルあたり）は、トランスフェクション効率が最大となるように、予備試験を行って決定してください。

  注：複数のプラスミドをトランスフェクションする場合（例： CRISPR/Cas9 KO プラスミドとHDRプラスミド）、同等の比率でプラスミドDNAを混合してください。

  溶液A： 1回のトランスフェクションにつき、プラスミドDNA 1-3 µg を、プラスミドトランスフェクション培地（品番： SC-108062）で最終容量が 150 µL になるように希釈します。ピペッティングにより混合します。室温で5分間静置します。

  溶液B： 1回のトランスフェクションにつき、UltraCruz® トランスフェクション試薬（品番： SC-395739） 5-15 µL を、十分な量のプラスミドトランスフェクション培地（品番： SC-108062）で最終容量が 150 µL になるように希釈します。ピペッティングにより混合します。室温で5分間静置します。

  注： プラスミドトランスフェクション培地（品番： SC-108062）には抗生物質を加えないでください。

• プラスミドDNA溶液（溶液A）を、希釈した UltraCruz® トランスフェクション試薬（溶液B）に、ピペットを用いて直接滴下します。すばやくボルテックスし、室温で20分以上インキュベートします。
• トランスフェクションの前に、培地を新しい抗生物質不含の増殖培地に交換します。プラスミドDNA / UltraCruz® トランスフェクション試薬複合体（溶液A + 溶液B） 300 µL を、ウェルに滴下して加えます。
• プレートをゆっくりと回して混合します。
• 細胞を、通常の培養条件で 24-72 時間インキュベートします。トランスフェクション後の最初の24時間は、培地を交換する必要はありません。トランスフェクション 24-72 時間後に、必要に応じて培地を足すか、交換します。

  注： 常にコントロールを含んだトランスフェクション実験の実施を推奨します。（コントロール CRISPR/Cas9プラスミド：SC-418922）

• 完全な表現型および/または遺伝子型解析は、対立遺伝子の完全なノックアウトを確認するために、単一細胞コロニーの単離を必要とする場合があります。
• タンパク質分析用に、細胞を溶解する3日前に、標準的な増殖培地に交換します。接着細胞を溶解する場合、培地を吸引後、PBSで細胞をリンスし、スクレイプおよび低速で遠心分離して細胞ペレットを得ます。浮遊細胞の場合、細胞培養物を遠心分離管に移し、低速で遠心分離して細胞ペレットを得ます。PBSで一回洗浄し、再度遠心分離します。100% コンフルエント HEK 293細胞またはHeLa細胞の場合、100 µlのRIPA Lysis Buffer System（品番：sc-24948）をペレットに添加します。他の細胞株でのRIPA Lysis Buffer Systemの使用量は、試験を行って決定する必要があります。細胞を超音波処理またはシェアします。10分間氷上でサンプルをインキュベートし、ボルテックスし、氷上で10分間、再度インキュベートします。10,000rpm、4℃、20分間の条件で細胞溶解物を遠心します。BCAタンパク質アッセイキット（品番：SC-202389）を使用して、タンパク質濃度を決定します。
• RT-PCR分析用には、RNAを市販のRNA単離キットまたは、P.Chomczynski and N. Sacchi（1987）によって報告された方法で単離します（Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159）

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