FAQ : Enzo Life Sciences（ENZ）社 検出キットについて

いいえ、できません。本アッセイは、生細胞アッセイです。

GFPと蛍光基質の発光スペクトルが重複するため、GFP発現細胞の使用はお奨めしません。GFP発現細胞をお使いの場合、Enzo Life Sciences社の"cellular senescence activity assay (品番ENZ-KIT129-0120)" をご検討下さい。ただし、こちらのキットはフローサイトメトリでの分析には適しません。

ENZ-KIT130-0010 は、浮遊細胞をはじめとした全ての哺乳動物細胞に使用できます。プロトコールのステップ１で、培地を吸引除去する前に遠心して細胞を沈降させて下さい。それ以降のプロトコールは同じです。

SA-βガラクトシダーゼは老化細胞全てに対してユニバーサルなマーカーです。そのため、本アッセイは特定細胞種に特化したものではありません。

コラーゲンは本アッセイに干渉しません。したがって、細胞をコラーゲンコートプレートで培養しても問題ありません。

老化細胞には、SA-βガラクトシダーゼとリソソームβガラクトシダーゼといった主に2種類のβガラクトシダーゼがあります。後者はpH 4.0においてのみ検出できます。"cell pre-treatment solution"はリソソームのアルカリ化を誘導してリソソームのβガラクトシダーゼ活性を最小限に抑えます。

このアッセイはX-Galと同様の活性を検出しますが、より高感度です。もしX-Galで視覚的な相違が検出できた場合、ENZ-KIT130-0010 によりフローサイトメトリーを用いて検出できます。

特に SA-βガラクトシダーゼ活性の低い細胞では、一晩培養の方がよい結果が得られる可能性があります。

ENZ-KIT130-0010 は生細胞アッセイのため、通常の生長条件で培養する必要があります。対象細胞の培養条件が 5% CO₂であれば、アッセイ中もその条件下で培養します。培養器の CO₂環境はアッセイの pHに影響を及ぼしません。

"cell pre-treatment solution" は細胞に対して無毒であり細胞死を誘導しないはずです。ただし、細胞種によっては処理後に形態変化することがあるようです。形態変化をしたとしても、SA-βガラクトシダーゼ活性には影響を与えないと思われます。

本アッセイでは生細胞を使用しますので、2、3時間内に分析することをお奨めします。もし細胞が溶解してしまうと、色素が流れ出してしまいます。

蛍光は数時間から1日程度持続します。

本アッセイでは、蛍光基質を使用して細胞可溶化液中の SA-βガラクトシダーゼ活性を測定します。キットに含まれるバッファーは、アッセイの間pH を pH6,0 に維持し、リソソームのβガラクトシダーゼ活性を抑制しつつ SA-βガラクトシダーゼ測定に至適な条件を保持することができます。

細胞ライセートの SA-βガラクトシダーゼ活性を検出して老化を測定します。非蛍光基質が SA-βガラクトシダーゼによって加水分解されると、360/465nmで測定できる青色蛍光を発光します。反応溶液に添加する停止溶液には、固定点で反応を停止させつつ蛍光を最大化する成分が含まれています。

このアッセイに使用する細胞数は老化させようと思う細胞割合によって変わります。まずは2x10^4から5x10^4程度からお試し頂くとよいでしょう。サンプル中の老化細胞の割合が高い場合、そこから希釈する必要があります。

SA-βガラクトシダーゼは老化細胞全てに対してユニバーサルなマーカーです。そのため、本アッセイは特定細胞種に特化したものではありません。

組織も使用できます。アッセイを行う前に、キットに含まれる 1×細胞溶解バッファーに組織を再懸濁した後、超音波をかけるかホモジナイズしてください。RIPA緩衝液は pH依存性基質には適合しないため、1×細胞溶解バッファーの代わりとして使用しないで下さい。

コラーゲンは本アッセイに干渉しません。したがって、細胞をコラーゲンコートプレートで培養しても問題ありません。

pH指示薬としてフェノールレッドを含む培地は、このアッセイを妨げる可能性があります。ほとんどの培地は、これを含まないものがオプションで提供されています。DMEMは硫酸第一鉄塩が含まれるため比色分析には使用しないで下さい。ヘモグロビンはトリガーとして使用されるため、化学発光アッセイを行う場合は培地に血清を添加しないで下さい。

Oxide (NO₂/NO₃) 検出キットではNOの主要な代謝産物 (硝酸塩と亜硝酸塩) の両方を検出します。Nitric Oxide (total) 検出キットでは、サンプルを硝酸還元化酵素で処理した後、これらの代謝物を単一量として測定します。どちらのキットを使用するかは、実験目的に応じてお選び下さい。

はい、使えます。最初に細胞から培地を除去します。ペレットをPBSで洗浄した後、キットの反応バッファーで細胞を可溶化します。

はい、この培地に使用されている硝酸塩が妨害します。培地組成を確認し、過剰量の硝酸塩が含まれないことを確認してください。

残念ながら非公開です。組成には添加物と栄養素が含まれています。これらは細胞のセレクション、安定性、および完全性維持に必須ですので、細胞増殖を始める際に他の培地を使用しないことをお奨めします。

液体窒素から取り出した細胞をそのまま使用することはお奨めできません。適切な結果を得るためには、細胞は対数増殖期で使用する必要があります。さらに、本細胞株は、形質転換細胞株のため、選択的な環境が必要です。"Cell Growth Medium" には選択試薬が含まれています。そのため、アッセイを行う前に細胞を "Cell Growth Medium" で培養する期間が必要です。アッセイで使用する細胞100 % がEnzo Life Sciences社のルシフェラーゼ-Wnt応答因子コンストラクトに陽性であることを確認するためにもこのセレクションは必要です。

細胞密度、培養培地、および培養条件といった状態に気をつけて下さい。96 well プレートには"Cell Growth Medium"の混入がないことを確認してください。"Cell Growth Medium"が含まれると細胞の順化がうまくいかなくなり、シグナルが低くなることがあります。"Cell Growth Medium" 中の細胞を PBS で洗浄後、Cell Assay Medium で適切な細胞密度にしてから 96 well プレートに添加します。考慮すべき他の要因は、脱イオン水中の Wnt3a の完全な再構成です。いったん再構成されたら、Wnt3a を Assay Diluent で希釈することができます。Wnt3a の至適濃度は 150 - 500 ng/mL の範囲でお客様により決定していただく必要があります。必要であれば Wnt3a と細胞の培養時間を12時間から20時間に延長してもよいでしょう。底面が透明な黒色 96 well プレートを使用するとwell 間のクロストークを抑えてシグナルノイズ比が改善できます。さらに、ルシフェラーゼ基質添加から10分後にプレート読み取りを行うことをお奨めします。20 - 25分以上経過するとシグナルが低減しはじめます。

マルチピペットを用いてルシフェラーゼ基質添加後、10分後にシグナルの読み取りを行います。基質をプレート全体に添加する程度の時間であればシグナルは安定しています。20 - 25分以上経過すると、シグナルが減少していきます。

LEDING LIGHT Wnt reporter cell line は遺伝学的操作を加えた 3T3マウス線維芽細胞株であり、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードしています。Wnt経路に焦点をあてた転写因子応答システムでは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子がENZ社独自の縦列反復した Wnt応答因子 (TCF/LEF) に連結された基本転写因子 (TATA box) の制御下にあります。外来性のWntタンパク質、Wntアゴニスト、またはWntアンタゴニストを細胞培養培地に添加することで、ルシフェラーゼ活性を用量依存性で制御できます。本細胞株構築には感染性の媒介物は使用していません。

LEDING LIGHT Wnt reporter cell lineは安定ではありますが、本細胞の培養をどの程度丁寧に行ったか (最大60%コンフルエントなど) によって、15?20継代程度でシグナルを失いはじめます。そのため、初代継代物をなるべくたくさん分注し凍結保存することをお奨めしています。分注保存することで長期に渡って実験を行うことができるでしょう。

古典的 Wntシグナル伝達経路では Wnt3a が最も一般的に研究されたアゴニストのため、本キットでは選択しました。本キットに含まれる Wnt3a は陽性コントロールとしての使用を目的としています。より大量の Wnt3aアゴニストが必要なお客様には、単品販売もしています。

"Leading Light® Wnt cell line medium pack (品番ENZ-60003-0001)" は、細胞凍結培地、細胞生長培地、アッセイ培地で構成されています。これらの培地には細胞の選択、安定性、および完全性を維持する抗生物質などの添加物が含まれています。本細胞の増殖やアッセイを行う際は、他の培地を使用しないことをお奨めします。これらの細胞は安定発現株ではありますが、適切な抗生物質を用いたセレクションを行わないと、実験に多大な影響を及ぼす可能性があります。古典的Wnt経路のアクチベーターやインヒビター存在下で良好なアッセイを行うために、Cell Assay Medium を用いて培養しておくことが非常に重要です。

細胞にトリプシンを添加する前に、Cell Growth Mediumを完全に除去することが重要です。通常、トリプシン処理時間が長すぎると凝集が起こります。また、トリプシン溶液にはEDTAの添加が必要であり、トリプシン処理に役立ちます。予め37℃に温めたトリプシン-EDTA溶液を 2 - 3 mL、非常に穏やかに細胞に添加し、37 ℃で 1 ? 3 分間培養します。凝集を防ぐためには、細胞が剥離するまでフラスコを振動させたり叩いたりしないこと、また細胞を無理に剥がさないことが重要です。培養時は1 分ごとに細胞を確認し、1 分後の段階で細胞が剥離している場合は、10 mL の Cell Growth Medium を優しく添加して次のステップに進みます。Cell Growth Medium をトリプシン処理した細胞に添加した後は、1 mL プラスチックチップを用いて穏やかにピペッティングし、1 : 4 もしくはそれ以上の割合で 100 mm 組織培養プレートに継代してください。

化学発光が読み取り可能なプレートルミノメーターが必要です。Leading Light® Wnt reporter cell lineの発光波長は 560 nmです。放射線測定器によっては使用できるものもあります。Enzo Life Sciences社では通常0.1秒積分時間を使用しています。非常に弱い場合は、1秒までのばしてもよいでしょう。