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Q&A

記事ID : 17918

FAQ : Enzo Life Sciences(ENZ)社 ELISA Q&A

1. EnzoLifescience社 ELISA Q&A(全般)について

■ 装置

■ サンプルマトリクスとサンプル種

■ データ解析

■ 化学発光分析

2. サイクリックヌクレオチド(cAMP/cGMP) ELISA kit » 商品詳細はこちら

■ 共通 Q&A

■ Direct cAMP/cGMP ELISAキット Q&A

■ Direct もしくは Standard cAMP/cGMP ELISAキット 共通 Q&A

■ Standard cAMP/cGMP ELISAキット Q&A

■ Complete もしくは Standard cAMP/cGMP ELISAキット 共通 Q&A

3. 内分泌/ホルモン

■ Corticosterone ELISA kit » 商品詳細はこちら

■ Cortisol ELISA kit » 商品詳細はこちら

■ 17β-Estradiol ELISA kit » 商品詳細はこちら

■ Oxytocin ELISA kit » 商品詳細はこちら

■ Progesterone ELISA kit » 商品詳細はこちら

■ Serotonin ELISA kit » 商品詳細はこちら

■ Testosterone ELISA kit » 商品詳細はこちら

■ Arg8-Vasopressin ELISA kit » 商品詳細はこちら

4. エイコサノイド

■ Urinary prostacyclin ELISA kit » 商品詳細はこちら

5. 代謝

■ NGAL ELISA kit » 商品詳細はこちら

6. 酸化ストレス

■ HO-1, ELISA kit » 商品詳細はこちら

7. HPS70 ELISA キット

■ HPS70 ELISA キット » 商品詳細はこちら

8. BIOLIKE™ コンフォメーショナル ELISAキット

■ BIOLIKE™ コンフォメーショナル ELISAキット » 商品詳細はこちら

9. その他ELISAキット

E. coli Host Cell Protein ELISA Kit » 商品詳細はこちら

■ CHO host cell protein ELISA kit » 商品詳細はこちら

1. EnzoLifescience社 ELISA Q&A(全般)について

■ 共通 Q&A

【1-01】 波長補正は必要ですか?

2波長測定は、ランプや装置、プラスチックプレートによる光学密度のずれを補正します。エンゾライフサイエンス社 (ENZ社) の プレートは、光学品質用に選択されているため、実質的に補正される値はごく小さいものです。2波長測定機能が使用できない場合でも、推奨検出波長で測定していただければ、大きな問題はありません。

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【1-02】 分光光度計で測定することはできますか?

製品マニュアルに分光光度計で測定可能と明記されていない限り、測定はできません。ほとんどのイムノアッセイ及びELISAキットは、マイクロタイタープレートリーダーで測定しなければなりません。分光光度計で確実に測定するには、サンプルボリュームが少なすぎます。

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■ サンプルマトリクスとサンプル種

【1-03】 キットが適用できる種は?

キットの測定対象が、全ての種で保存されているような分子(例:エイコサノイド、ステロイド)の場合、種に依存せず、どのような種でも使用できる可能性があります。種特異的なキットの場合は、その種の名前を記載しています。もしマニュアルに種の記載がない場合、特定の種を測定対象としていません。各製品のウェブサイトでも掲載しています。

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【1-04】 サンプルを希釈又は抽出する必要があるかどうかはどのように判断すればよいですか?

それぞれのキットで示されているサンプルタイプごとの推奨最低希釈率でサンプルを希釈しても、キットの測定範囲内に測定対象物質の濃度が収まるのであれば、サンプルを希釈して測定することをお奨めします。もしサンプル濃度が定量限界より低い場合は、抽出・濃縮が必要になります。抽出が必須なキットもありますが、その場合は製品マニュアルに記載しています。

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【1-05】 サンプルの推奨最低希釈とは何ですか?希釈しなくても大丈夫ですか?

これはアッセイのマトリクス干渉を除くために必要な最低希釈のことです。特殊なサンプルの場合は、より高い倍率で希釈する必要があります。特殊なサンプルの最適な倍率は、お客様自身でバリデーション試験を行い決定してください。試験せずに希釈をすることはお奨めできません。もしサンプル中の対象物質が低レベルで存在するなら、抽出作業を行ったほうが正確に測定できる可能性があります。

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■ データ解析

【1-06】 培地中でのスタンダード曲線に一貫性がありません。

多くの場合、培地中に添加された血清が問題になります。血清は水より密度が重いため、混合が不足すると容器の底に沈んでしまいます。この問題を最小限にするには、非馴化培地を室温に戻し、スタンダードの希釈の前によく混合することが重要です。

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【1-07】 OD値がマニュアルの値と一致しません

実験間でOD値に若干の差があることは通常のことです。OD値は温度による若干の影響を受けます。室温でのインキュベート時に、プレートを冷えた実験台の上やドラフトの下などに置かないように注意してください。基質のインキュベートを25〜37℃で実行すれば、シグナル値の変動の改善が期待できます。

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【1-08】 データを解析する最もよい方法は?4-PLカーブフィッティングとは?

正確な結果を得るために、4パラメーターロジスティック(4-PL)カーブフィッティングソフトウェアを使用することを推奨します。4-PLは、近似曲線を最適化します。免疫測定において、スタンダード曲線はめったに直線になりません。得られたデータによりフィットするカーブを選択することで、最終的に正確なサンプル値を得ることができます。このソフトウェアが利用できない場合、自分でデータをプロットして値を算出する必要があります。ほとんどのマイクロプレートリーダーはソフトウェアを備えています。

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■ 化学発光分析

【1-09】 どのような場合にEIAの代わりにCLIAを使用するのが適切ですか?

CLIA(化学発光免疫測定;chemiluminescent immunoassay)は、EIA(酵素免疫測定法;enzyme immunoassay)よりも高感度であるため、サンプル中に含まれる分析対象レベルがEIA検出レベルよりも低い場合に利用されます。また、マトリクス影響のない状態にまでサンプルを希釈できるため、抽出操作を省略できることも利点です。

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【1-10】 CLIAアッセイの測定に必要な装置は?

RLU(相対発光強度;relative light units)を測定するためのルミノメーターが必要です。フィルターは不要です。

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2. サイクリックヌクレオチド(cAMP/cGMP) ELISA kit » 商品詳細はこちら

■ 共通 Q&A

【2-01】 プレートは抗ウサギIgGでコートされていますが、ウサギ血清中のcAMP/cGMPレベルを測定することはできますか。

これらキットで使用するプレートにはcAMP もしくは cGMP特異的抗体を捕捉する抗体でコートしてあります。これらのキットで使用している抗体はヤギ抗ウサギIgG抗体のため、高い内在性IgGレベルのウサギサンプルでは問題が生じ、競合アッセイとして満足できる結果を得るためのサンプル、コンジュゲート、および抗体のバランスが崩れて cAMP/cGMPアッセイに干渉する可能性があります。こういったサンプルを使用する場合は、アッセイを行う前に、干渉する IgG を MWCOフィルターやIgG removal kitで除去することをお奨めします。ただし、Enzo Life Sciences社ではこの点を検討しておらず、お客様ご自身で最適化していただく必要がございます。

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【2-02】 サンプル中の期待される cAMP/cGMP濃度はどの程度でしょうか。

サンプル中のcAMPとcGMP量は、サンプルタイプ、由来、または処理によっても異なります。残念ながら予測はできません。お客様ご自身で、同様のサンプルタイプ、条件、アッセイ技術を用いて検討した参考文献などをお探しいただき、ご確認ください。

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【2-03】 サンプルの乾燥方法を教えて下さい。

サンプルは、吸引遠心器 (SpeedVacなど) や窒素やアルゴンの緩やかな気流で乾燥させます。サンプル数が多い場合、吸引遠心器の方がよいかもしれません。サンプルを室温で一晩、SpeedVacに入れて放置します。翌日には乾燥しており、吸引中は環境下に晒されていないため、サンプルの完全性は損なわれていないはずです。緩やかな窒素の気流を使って乾燥させる場合、ガス供給部の下にガラスピペットを装着し、ピペットをサンプルチューブ内底部に吊るします。この方法を用いる場合、まずは石油エーテルを入れたチューブでまずは練習し、どのくらい時間がかかるか確認してください。サンプルをフード内に放置して乾燥させることはお奨めしません。サンプルが酸化し、わずかに残った溶剤がEIAに影響を及ぼす可能性があるためです。

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【2-04】 アセチル化工程は必ず必要ですか。

非常に低濃度の cAMPもしくはcGMPしか含まないサンプルの場合や、より高感度が求められる場合にはサンプルをアセチル化する必要があります。アセチル化による感受性は、アセチル化されていないものに比べて10倍程度高くなります。サンプル内の環状ヌクレオチドレベルが不明な場合、まずはあまり重要でないサンプルを用いてアセチル化せずにアッセイを行い、この過程が必要かどうかをご判断ください。

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【2-05】 アセチル化標準物質とサンプルへの最大結合量が50 % しかありませんでした。なぜでしょうか。

標準物質とサンプルがアセチル化されているもののB0標準物質がアセチル化されていないと、このようになります。この場合でも、データは使えます。光学濃度曲線からサンプル濃度を算出し、%B/B0 分析は行いません。

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【2-06】 受容体活性化作用と拮抗作用研究にこれらのキットは使用できますか。

実験デザインが構築されていて、最終サンプルを提案通りにアッセイに組込むことができ、またキットが検出できる十分量のcAMP/cGMPが存在するのであれば、これらのキットを使って受容体活性化作用や拮抗作用により生ずる様々な変化を検出できるでしょう。もちろん、サンプル中の cAMP/cGMP検出限界はお客様が構築する必要があり、また対象アゴニスト/アンタゴニスト処理の最適化も必要です。

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■ Direct cAMP/cGMP ELISAキット Q&A

【2-07】 Direct ELISAキットで細胞質の cAMP/cGMP を検出できますか。

本品は、細胞種に依存せず、細胞・組織ライセートの細胞内 cAMP/cGMPを比色定量できます。

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【2-08】 cAMP direct ELISA kitのAssay Buffer で希釈したサンプルは cGMP direct ELISA kitで使用できますか。また、その逆はどうでしょうか。

これらの2つのキットの Assay Buffers は同一カタログ番号であり、同一商品ですのでご使用いただけます。ただし他の試薬はそれぞれのDirect ELISA kitの使用方法に従ってご利用ください。

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■ Direct もしくは Standard cAMP/cGMP ELISAキット 共通 Q&A

【2-09】 どの程度の細胞数を使用するべきですか。

使用する組織量や細胞数は実験条件によります。初期実験は、1、2種類の代表的なサンプルを用いて、およそ2 - 5百万細胞/mL-HCl から始めることをお奨めします。その試験結果をうけて、以後のサンプルを適切に推測できるでしょう。濃縮ストックを希釈して使用する方が、実験を最初からやり直すよりも容易であることにご留意下さい。

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【2-10】 独自の可溶化バッファーを使用してもよいでしょうか。

本キットは標準物質とサンプルの可溶化と希釈に、中和試薬との組み合わせでHClを使用するよう最適化されています。もし異なるバッファーで可溶化し、その後 HClで希釈すると、pHが異なってしまいます。(他のバッファーを使用するとHClを中和するようデザインされた中和試薬のモル濃度が異なってしまう可能性があります。) そのため、最適な結果を得るためにも、HCl を可溶化と希釈の両方にご利用ください。

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【2-11】 0.1M HCl添加後も細胞が可溶化しない場合はどうすればよいですか。

使用前に0.1〜1 % トリトンX100 を 0.1 M HCl に添加することで細胞や組織の可溶化を促進できます。この濃度域で使用する場合は、界面活性剤がアッセイのアセチル化や結合部分を妨害しません。ただし、OD値が若干増加する可能性があります。正確な判定を行うために、トリトンX100を含むサンプルを同じトリトンX100含有バッファーで希釈した検量線を用いて評価してください。

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【2-12】 細胞での検出で、一貫性のあるデータが得られません。細胞が透過性になったのでしょうか。

一貫性のある結果を得るため、アッセイで使用する前に細胞を完全に破壊させることをお奨めします。細胞の耐久力は細胞株によって異なるため、顕微鏡で確認して細胞破壊をご確認ください。

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■ Standard cAMP/cGMP ELISAキット Q&A

【2-13】 これらのELISAキットで細胞質のcAMP/cGMPを検出できますか。

いいえ、できません。これらは動物種によらず、培養上清、血清、唾液の細胞外cAMP/cGMPを比色定量します。細胞内 cAMP/cGMPを定量する場合、Enzo Life Sciencesの Direct ELISA kit (cAMPは品番ADI-900-066、cGMPは品番ADI-900-014)をご利用ください。細胞内外の cAMP/cGMP濃度両方を測定したい場合は、cAMPは品番ADI-900163、cGMPは品番ADI-900-163をご利用ください。

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【2-14】 cAMP ELISA kitのAssay Bufferで希釈したサンプルはcGMP ELISA kitで使用できますか。また、その逆はどうでしょうか。

これらの2つのキットの Assay Buffers は同一カタログ番号であり、同一商品ですのでご使用いただけます。ただし他の試薬はそれぞれのELISA kitの使用方法に従ってご利用ください。

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■ Complete もしくは Standard cAMP/cGMP ELISAキット 共通 Q&A

【2-15】 血清サンプルの再調整に必要なAssay Buffer量を教えて下さい。

サンプルを再調整するために必要なアッセイバッファー量は、実験条件に依存します。血清1 mLに対しアッセイバッファー1mLで再懸濁することをお奨めします。それからいくつか希釈倍率を振ってみてください。

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【2-16】 どの程度のサンプルが必要ですか、また推奨希釈率を教えて下さい。

必要なサンプル量と希釈率はサンプルに含まれ るcAMP/cGMP量によって決まります。お客様ご自身で、同様のサンプルタイプ、条件、アッセイ技術を用いて検討した参考文献などをお探しいただき、ご確認ください。

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【2-17】 アッセイバッファーに再溶解後、サンプルはどれくらい保存できますか。

再溶解後のサンプルの長期安定性は、Enzo Life Sciences社では確認していませんが、なるべく早くご使用になることをお奨めします。長期保存を行う場合は、-80℃で保存して下さい。

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【2-18】 培養上清中の cAMP/cGMP を cAMP/cGMP ELISAキットとcAMP/cGMP Complete ELISAキットを使って測定する時、どのような培地でも測定できますか?

プロトコールに記載されている通り、分泌型 cAMP/cGMPが含まれるサンプルの培養培地と同じものを使って検量線を作製していれば、光学密度 (OD) 変化に多少の変化があっても比較することができます。本キット開発時に、cAMP/cGMPを添加したフェノールレッド含有RPM1640 と DMEM+Glutamax を使用したことがありますが、若干のOD上昇は見られたものの、この影響は標準物質とサンプル双方に影響を及ぼしていました。Enzo Life Sciences社ではお客様ご自身でサンプルの希釈最適化を行い、またご自身のサンプルで添加回収試験を行って良好なサンプル回収と線形データが得られることをご確認頂くようお奨めしています。

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3. 内分泌/ホルモン

■ Corticosterone ELISA kit » 商品詳細はこちら

【3-01】 コルチコステロンELISA キットはどの動物種にも使えますか。

コルチコステロンは全動物種で保存されており、本キットで使用する抗体は動物種に関わらずコルチコステロンに結合します。したがって、本製品は基本的に 「動物種非依存性」 です。ただし、もしヒツジ由来のサンプルで IgG を含む場合 (血清や血漿サンプルのように)、注意が必要です。ご提供するプレートはヒツジIgG捕捉抗体でコートしていますので、サンプルに内在性ヒツジIgGが含まれる場合は干渉することが考えられます。

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【3-02】 プロトコールに自分が対象とするサンプルタイプが記載されていませんでした。どうしたら使えますか。

Enzo Life Sciences社ウェブサイトの 「Application」 およびキットのプロトコールに、本品を用いて良好に試験が行えたサンプルタイプをリスト化しています。サンプル内に十分量の分析物が存在し、マトリックス干渉を除去するために十分な希釈を行った後もその濃度が検量線範囲内であれば、リスト以外のサンプルタイプでもアッセイできるはずです。もしEnzo Life Sciences社で検証していないサンプルタイプをご使用になる場合は、既報論文に詳細が記載されていないかご確認ください。

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【3-03】 自分で使用するサンプルタイプの最適な希釈率を教えて下さい。

マニュアルの"Sample recoveries"セクションに推奨希釈率を記載しています。この値は、Enzo Life Sciences社にてマトリックス干渉を除くために必要だと決定した希釈率です。ただし、お客様ご自身で、対象サンプルにおける最適希釈率を決定されることをお奨めします。そのため、Enzo Life Sciences社の推奨希釈率は"出発点"としてご理解ください。

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【3-04】 糞便中のコルチコステロンレベルの定量を考えています。本アッセイに適したサンプル調製方法を教えて下さい。

キットのマニュアルには、動物園と提携してマウスやサイの糞便サンプルを採取・試験した結果の推奨希釈率を掲載しています。以下は糞便抽出プロトコールの一案です。
1. 16x125 mm ポリプロピレンチューブに抽出番号を記載する。
2. わらや細片を注意して取り除き、0.5 g (+/- 0.05) の混合した解凍糞便サンプルを対応するチューブに量り入れる。
3. 糞便抽出シートに重量を記載し、状態 (いつもよりも湿っているもしくは乾燥状態、毛玉など) を記録する。
4. 必要に応じて、今後使用するためのサンプル用に、12x75 mm ポリプロピレンチューブに動物ID (名前)、サンプル番号、日付を記載したラベルをし、サンプルを入れ凍結保存しておく。
5. dH2Oで調製した80% EtOH を 5 mL 加え、直ちにチューブに蓋をする。
6. 全ボトルを十分にボルテックスし、サンプルをばらばらにする。
7. チューブを試験管立てに立てて、ローター上に水平方向に設置し、14-18時間混合する (一晩)。
8. チューブを 1500 rpmで 15 分間遠心する。
9. サンプル分の 12x75 mmポリプロピレンチューブを用意し、動物ID (名前)、サンプル番号、日付および1:10 と希釈率を記載したラベルをし、1 mL アッセイバッファーをいれ、1mL 上清を対応するチューブに入れた後、蓋をして冷凍保存する。
10. 糞便と希釈物を格子箱に入れて保存する。箱には、動物種、動物ID (名前と番号)、性別 (0.1か1.0)、糞便、希釈率1:10、動物園名、サンプル番号の始めと終わり、日付を明記する。本プロトコールは10倍希釈です。EtOH中に5倍、当初の容量が5mLでバッファーで2倍希釈しているためです。

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【3-05】 最少サンプル量を教えてください。

アッセイにはウェルごとに100 µL の希釈サンプルが必要です。そのためサンプル希釈率やサンプル数によってご判断ください。サンプルは二回繰返し (duplicate) で試験します。

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【3-06】 キットマニュアルの "Sample Handling" で、"サンプルによっては分析物の存在レベルが非常に低く、正確に測定するためには抽出が必要となる場合があります"とあります。どの濃度範囲のことを示しているのでしょうか。

サンプル中の分析物濃度がアッセイの検出限界未満である場合にのみ抽出が必要です。マトリックス干渉を除去するために十分な希釈を行った後でもサンプルから分析物が検出できるのであれば、抽出は必要ありません。もし試験の結果、ステロイドが読み取り不可であった場合、抽出が必要です。

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【3-07】 Steroid displacement reagent (SDR) のメカニズムを教えて下さい。

血液中のほとんどのステロイドはアルブミンや、より特異的な結合タンパク質などの担体タンパク質にイオン結合しています。サンプルを Steroid Displacement Reagent で処理することで、ステロイドと担体タンパク質間の電荷相互作用を破壊します。これによりサンプル中に存在するステロイド全量を測定することができます。

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【3-08】 Steroid displacement reagent (SDR) によるサンプル処理方法を教えて下さい。

以下に従い、Steroid displacement reagent でサンプルを処理してください。
・サンプル97.5 µLごとに2.5 µLのSDRを添加する。
・ボルテックスに短時間掛け、室温で5分静置する。
・その後、サンプル希釈を行う。
血清や血漿以外のサンプルを使用する場合、SDR処理は必要ありません。抽出物サンプルの場合もSDR処理の必要はありません。

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【3-09】 このELISAキットでは、なぜサンプル希釈が必要ですか。

希釈することにはいくつかの理由があります。サンプルが検量線を超える場合、本アッセイの検量線内で測定できるように希釈が必要となる場合があります。また、サンプルによってはマトリックス干渉を防ぐために希釈が必要な場合があります。

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【3-10】 サンプルマトリックス干渉はどうすれば防ぐことができますか。

サンプルマトリックス干渉を防ぐ最も簡単な方法は、アッセイバッファーでサンプルを希釈することです。最低必要希釈率を決定するには、1つのサンプルを2分割します。1つには既知量の標準物質を加えます。2分割とも、アッセイバッファーを用いて段階希釈系列をとります (1 : 2、1 : 4、1 : 8、1 : 16など)。その後、これらのサンプル全てを本品で分析し、各希釈サンプルに対して濃度と回収率を決定します。回収率が添加分析物の量に対して 80 % 〜 120 % になったときが最低必要希釈率です。もし、サンプルを希釈後、分析物濃度が本アッセイでの分析範囲内に入るような場合は、その希釈率が一番最良です。もし、そうならなかった場合は、マニュアルに沿って抽出作業が必要になります。

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【3-11】 自分のサンプルにマトリックス干渉の可能性があるかを確認する方法を教えて下さい。

マトリックス干渉とは、サンプルマトリックス(バッファー、pH、界面活性剤や溶剤などの添加物、タンパク質など)がアッセイを妨害し、不正確な結果を導くことを示します。このような干渉は誤った抑制、または誤った分析物レベルの上昇として現れます。マトリックス干渉を試験する方法として、添加回収率の確認があります。代表とするサンプル (1つか2つ) を2分割します。1つには既知量の分析物 (標準物質) を添加します。このサンプルは"添加サンプル (spiked sample)"と呼びます。同時に、添加サンプルと添加していないサンプルをアッセイします。添加物の回収率は、内在性寄与物 (添加していないサンプルにおける測定濃度) を添加サンプルの全分析物濃度から減算し、添加サンプルに添加した標準物質濃度で割った後100倍します。許容できる回収率は添加サンプルの80%から120%です。

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【3-12】 希釈率で結果を掛け算すべきでしょうか。

はい。算出したデータに希釈率を掛け合わせ、サンプル中に存在する生物マーカー存在量の正しい値を算出します。

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【3-13】 他のステロイドとの交差反応は確認してありますか。

はい。関連するステロイド化合物に関する交差性を評価し、キットマニュアルに記載しています。

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【3-14】 ステロイドが対象のELISAキット用陽性コントロールは販売していますか。

陽性コントロールの提供はしていません。もし特定サンプルタイプから分析物を正確に回収できているかを確認する場合、既知量の標準物質をサンプルに添加し、キットを使ってアッセイを行い、回収率を評価して下さい。

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■ Cortisol ELISA kit » 商品詳細はこちら

【3-15】 どの動物種に対しても使用できますか。

コルチゾールは全動物種で保存されており、本キットで使用する抗体は動物種に関わらずコルチゾールに結合します。したがって、本製品は基本的に 「動物種非依存性」 です。ただし、もしマウス由来のサンプルで IgG を含む場合 (血清や血漿サンプルのように)、注意が必要です。ご提供するプレートはマウスIgG捕捉抗体でコートしていますので、サンプルに内在性マウスIgG が含まれる場合は干渉することが考えられます。

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【3-16】 プロトコールに自分が対象とするサンプルタイプが記載されていませんでした。どうしたら使えますか。

Enzo Life Sciences社ウェブサイトの 「Application」 およびキットのプロトコールに、本品を用いて良好に試験が行えたサンプルタイプをリスト化しています。サンプル内に十分量の分析物が存在し、マトリックス干渉を除去するために十分な希釈を行った後もその濃度が検量線範囲内であれば、リスト以外のサンプルタイプでもアッセイできるはずです。もしEnzo Life Sciences社で検証していないサンプルタイプをご使用になる場合は、既報論文に詳細が記載されていないかご確認ください。

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【3-17】 自分で使用するサンプルタイプの最適な希釈率を教えて下さい。

マニュアルの"Sample recoveries"セクションに推奨希釈率を記載しています。この値は、Enzo Life Sciences社にてマトリックス干渉を除くために必要だと決定した希釈率です。ただし、お客様ご自身で、対象サンプルにおける最適希釈率を決定されることをお奨めします。そのため、Enzo Life Sciences社の推奨希釈率は"出発点"としてご理解ください。

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【3-18】 最少サンプル量を教えてください。

アッセイにはウェルごとに100 µLの希釈サンプルが必要です、したがって、サンプル希釈率やサンプル数によってご判断ください。サンプルは二回繰返し (duplicate) で試験します。

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【3-19】 キットマニュアルの "Sample Handling" で、"サンプルによっては分析物の存在レベルが非常に低く、正確に測定するためには抽出が必要となる場合があります"とあります。どの濃度範囲のことを示しているのでしょうか。

サンプル中の分析物濃度がアッセイの検出限界未満である場合にのみ抽出が必要です。マトリックス干渉を除去するために十分な希釈を行った後でもサンプルから分析物が検出できるのであれば、抽出は必要ありません。もし試験の結果、ステロイドが読み取り不可であった場合、抽出が必要です。

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【3-20】 Steroid displacement reagent (SDR) のメカニズムを教えて下さい。

血液中のほとんどのステロイドはアルブミンや、より特異的な結合タンパク質などの担体タンパク質にイオン結合しています。サンプルを Steroid Displacement Reagent で処理することで、ステロイドと担体タンパク質間の電荷相互作用を破壊します。これによりサンプル中に存在するステロイド全量を測定することができます。

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【3-21】 Steroid displacement reagent (SDR) でサンプルを処理する方法を教えてください。

以下に従い、Steroid Displacement Reagent でサンプルを処理してください。
・99 µLのサンプルごとに 1 µLの SDR を添加する。
・ボルテックスに短時間掛け、室温で5分静置する。
・その後、サンプル希釈を行う。
抽出サンプルの場合は、SDR処理の必要はありません。

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【3-22】 このELISAキットでは、なぜサンプル希釈が必要ですか。

希釈することにはいくつかの理由があります。サンプルが検量線を超える場合、本アッセイの検量線内で測定できるように希釈が必要となる場合があります。また、サンプルによってはマトリックス干渉を防ぐために希釈が必要な場合があります。

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【3-23】 サンプルマトリックス干渉はどうすれば防ぐことができますか。

サンプルマトリックス干渉を防ぐ最も簡単な方法は、アッセイバッファーでサンプルを希釈することです。最低必要希釈率を決定するには、1つのサンプルを2分割します。1つには既知量の標準物質を加えます。2分割とも、アッセイバッファーを用いて段階希釈系列をとります (1 : 2、1 : 4、1 : 8、1 : 16など)。その後、これらのサンプル全てを本品で分析し、各希釈サンプルに対して濃度と回収率を決定します。回収率が添加分析物の量に対して 80 % 〜 120 % になったときが最低必要希釈率です。もし、サンプルを希釈後、分析物濃度が本アッセイでの分析範囲内に入るような場合は、その希釈率が一番最良です。もし、そうならなかった場合は、マニュアルに沿って抽出作業が必要になります。

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【3-24】 自分のサンプルにマトリックス干渉の可能性があるかを確認する方法を教えて下さい。

マトリックス干渉とは、サンプルマトリックス(バッファー、pH、界面活性剤や溶剤などの添加物、タンパク質など)がアッセイを妨害し、不正確な結果を導くことを示します。このような干渉は誤った抑制、または誤った分析物レベルの上昇として現れます。マトリックス干渉を試験する方法として、添加回収率の確認があります。代表とするサンプル (1つか2つ) を2分割します。1つには既知量の分析物 (標準物質) を添加します。このサンプルは"添加サンプル (spiked sample)"と呼びます。同時に、添加サンプルと添加していないサンプルをアッセイします。添加物の回収率は、内在性寄与物 (添加していないサンプルにおける測定濃度) を添加サンプルの全分析物濃度から減算し、添加サンプルに添加した標準物質濃度で割った後100倍します。許容できる回収率は添加サンプルの80%から120%です。

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【3-25】 希釈率で結果を掛け算すべきでしょうか。

はい。算出したデータに希釈率を掛け合わせ、サンプル中に存在する生物マーカー存在量の正しい値を算出します。

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【3-26】 他のステロイドとの交差反応は確認してありますか。

はい。関連するステロイド化合物に関する交差性を評価し、キットマニュアルに記載しています。

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【3-27】 ステロイドが対象のELISAキット用陽性コントロールは販売していますか。

陽性コントロールの提供はしていません。もし特定サンプルタイプから分析物を正確に回収できているかを確認する場合、既知量の標準物質をサンプルに添加し、キットを使ってアッセイを行い、回収率を評価して下さい。

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■ 17β-Estradiol ELISA kit » 商品詳細はこちら

【3-28】 17β-Estradiol ELISA kit はどの動物種由来のサンプルにも使えますか。

17β-Estradiolは全動物種で保存されており、本キットで使用する抗体は動物種に関わらず17β-Estradiolに結合します。したがって、本製品は基本的に 「動物種非依存性」 です。ただし、もしウサギ由来のサンプルで IgG を含む場合 (血清や血漿サンプルのように)、注意が必要です。ご提供するプレートはウサギIgG捕捉抗体でコートしていますので、サンプルに内在性ウサギIgG が含まれる場合は干渉することが考えられます。

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【3-29】 プロトコールに自分が対象とするサンプルタイプが記載されていませんでした。どうしたら使えますか。

Enzo Life Sciences社ウェブサイトの 「Application」 およびキットのプロトコールに、本品を用いて良好に試験が行えたサンプルタイプをリスト化しています。サンプル内に十分量の分析物が存在し、マトリックス干渉を除去するために十分な希釈を行った後もその濃度が検量線範囲内であれば、リスト以外のサンプルタイプでもアッセイできるはずです。もしEnzo Life Sciences社で検証していないサンプルタイプをご使用になる場合は、既報論文に詳細が記載されていないかご確認ください。

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【3-30】 本キットは血清や血漿サンプルにも使えますか。

Enzo Life Sciences社の研究室で検証済みのサンプルタイプは、培養上清と唾液です。血清と血漿サンプルは、品番ADI-900-174 「17β-Estradiol high sensitivity ELISA kit」 のご利用をお奨めします。

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【3-31】 自分で使用するサンプルタイプの最適な希釈率を教えて下さい。

マニュアルの "Sample recoveries" セクションに推奨希釈率を記載しています。この値は、Enzo Life Sciences社にてマトリックス干渉を除くために必要だと決定した希釈率です。ただし、お客様ご自身で、対象サンプルにおける最適希釈率を決定されることをお奨めします。そのため、Enzo Life Sciences社の推奨希釈率は "出発点" としてご理解ください。

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【3-32】 最少サンプル量を教えてください。

アッセイにはウェルごとに100 µL の希釈サンプルが必要です。そのためサンプル希釈率やサンプル数によってご判断ください。サンプルは二回繰返し (duplicate) で試験します。

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【3-33】 キットマニュアルの "Sample Handling" で、"サンプルによっては分析物の存在レベルが非常に低く、正確に測定するためには抽出が必要となる場合があります"とあります。どの濃度範囲のことを示しているのでしょうか。

サンプル中の分析物濃度がアッセイの検出限界未満である場合にのみ抽出が必要です。マトリックス干渉を除去するために十分な希釈を行った後でもサンプルから分析物が検出できるのであれば、抽出は必要ありません。もし試験の結果、ステロイドが読み取り不可であった場合、抽出が必要です。

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【3-34】 Steroid displacement reagent (SDR) のメカニズムを教えて下さい。

血液中のほとんどのステロイドはアルブミンや、より特異的な結合タンパク質などの担体タンパク質にイオン結合しています。サンプルを Steroid Displacement Reagent で処理することで、ステロイドと担体タンパク質間の電荷相互作用を破壊します。これによりサンプル中に存在するステロイド全量を測定することができます。

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【3-35】 17β-Estradiol ELISA kitを使用する場合、どのようにサンプルを Steroid displacement reagent (SDR) 処理すればよいですか。

以下に従い、Steroid Displacement Reagent でサンプルを処理してください。
・99 µLのサンプルごとに 1 µLの SDR を添加する。
・ボルテックスに短時間掛け、室温で5分静置する。
・その後、サンプル希釈を行う。
抽出サンプルの場合は、SDR処理の必要はありません。

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【3-36】 このELISAキットでは、なぜサンプル希釈が必要ですか。

希釈することにはいくつかの理由があります。サンプルが検量線を超える場合、本アッセイの検量線内で測定できるように希釈が必要となる場合があります。また、サンプルによってはマトリックス干渉を防ぐために希釈が必要な場合があります。

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【3-37】 サンプルマトリックス干渉はどうすれば防ぐことができますか。

サンプルマトリックス干渉を防ぐ最も簡単な方法は、アッセイバッファーでサンプルを希釈することです。最低必要希釈率を決定するには、1つのサンプルを2分割します。1つには既知量の標準物質を加えます。2分割とも、アッセイバッファーを用いて段階希釈系列をとります (1 : 2、1 : 4、1 : 8、1 : 16など)。その後、これらのサンプル全てを本品で分析し、各希釈サンプルに対して濃度と回収率を決定します。回収率が添加分析物の量に対して 80 % 〜 120 % になったときが最低必要希釈率です。もし、サンプルを希釈後、分析物濃度が本アッセイでの分析範囲内に入るような場合は、その希釈率が一番最良です。もし、そうならなかった場合は、マニュアルに沿って抽出作業が必要になります。

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【3-38】 自分のサンプルにマトリックス干渉の可能性があるかを確認する方法を教えて下さい。

マトリックス干渉とは、サンプルマトリックス(バッファー、pH、界面活性剤や溶剤などの添加物、タンパク質など)がアッセイを妨害し、不正確な結果を導くことを示します。このような干渉は誤った抑制、または誤った分析物レベルの上昇として現れます。マトリックス干渉を試験する方法として、添加回収率の確認があります。代表とするサンプル (1つか2つ) を2分割します。1つには既知量の分析物 (標準物質) を添加します。このサンプルは"添加サンプル (spiked sample)"と呼びます。同時に、添加サンプルと添加していないサンプルをアッセイします。添加物の回収率は、内在性寄与物 (添加していないサンプルにおける測定濃度) を添加サンプルの全分析物濃度から減算し、添加サンプルに添加した標準物質濃度で割った後100倍します。許容できる回収率は添加サンプルの80%から120%です。

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【3-39】 希釈率で結果を掛け算すべきでしょうか。

はい。算出したデータに希釈率を掛け合わせ、サンプル中に存在する生物マーカー存在量の正しい値を算出します。

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【3-40】 他のステロイドとの交差反応は確認してありますか。

はい。関連するステロイド化合物に関する交差性を評価し、キットマニュアルに記載しています。

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【3-41】 ステロイドが対象のELISAキット用陽性コントロールは販売していますか。

陽性コントロールの提供はしていません。もし特定サンプルタイプから分析物を正確に回収できているかを確認する場合、既知量の標準物質をサンプルに添加し、キットを使ってアッセイを行い、回収率を評価して下さい。

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■ Oxytocin ELISA kit » 商品詳細はこちら

【3-42】 動物種に依存しますか。

単一アミノ酸置換をもつ新規のオキシトシンフォームでは、抗体結合親和性に影響を及ぼす可能性があり、実際にいくつかの霊長類でその報告があります (Lee AG et al., 2011)。一方で、オキシトシン分子配列はほとんどの哺乳動物種間で相違がみられないことから、本キットは動物種非依存性と言えます。本キットを使用した論文報告で使用された動物種には、ヒヒ、ヒト、マウス、ブタ、ラット、アカゲザル、タマリンなどがあります。ウサギ血清を使用する場合には問題が生しる場合があるため、ご留意下さい。これはオキシトシン自身の問題ではなく、本キットで使用している抗体が抗ウサギIgGであるため、高シグナルバックグラウンドが生じてしまう可能性があるからです。

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【3-43】 ウサギ血清を使用しています。サンプルのオキシトシン検出に問題はありますか?

本キットでは抗ウサギIgGを使用しているため、ウサギサンプルは問題になる可能性があります。アッセイを行う前に、内在性ウサギ IgG を MWCOフィルターで除去するか、IgG除去キットで除去すれば、本品を使用できる可能性があります。ただし、Enzo Life Sciences社ではこの点を検討しておらず、お客様ご自身で最適化して頂く必要があります。

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【3-44】 オキシトシンキットは培養上清、牛乳、血漿、および血清の他のサンプルタイプにも使えますか。

脳脊髄液、唾液、組織、および尿にも使えます。

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【3-45】 オキシトシンELISAキットは唾液サンプルにも使えますか。

本キットの開発中に唾液サンプルは試していませんが、唾液中のオキシトシン検査の需要が増えています。一つの論文報告 (Holt-Lunstad J et al., 2008) では、どのように本キットに唾液サンプルを使用したか記述されています。他の複数の研究者も、以下のプロトコールによりこのマトリックスを使用しています。ただし、このプロトコールは、お客様がご利用のサンプルにあわせて最適化する必要がございます点、ご留意願います。
1. 1 mL 以上(3〜5 mL 以上を推奨)の唾液サンプルを回収する。保存する場合は-20℃で保存。
2. 遠心分離により微粒子や粘液を沈殿させる。
3. 上清を回収し、1mL ずつに分注する。
4. SpeedVac のような遠心エバポレーターで水分を蒸発させる。
5. 乾燥させたサンプルを 250 μL のアッセイバッファーに溶解する(オキシトシン濃度によって適宜アッセイバッファーの量を調整する)。

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【3-46】 オキシトシンELISAキットにはどれくらいのサンプルが必要ですか。また、推奨希釈率を教えて下さい。

必要なサンプル量と希釈率はサンプルに含まれるオキシトシンレベルに依存します。お客様ご自身で、同様のサンプルタイプ、条件、アッセイ技術を用いて検討した参考文献などをお探しいただき、ご確認ください。

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【3-47】 オキシトシンの抽出は必要ですか。

エンゾライフサイエンス社のオキシトシンELISAキットでは、血清や血漿からの抽出が必要です。この抽出は、血清や血漿のマトリックス干渉を防ぐために必要で、基礎レベルの問題ではありません。他のサンプルタイプでは抽出は必要ありません。

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【3-48】 血清や血漿サンプル中のオキシトシン抽出プロトコールに代替法はありますか。

水溶性サンプルからオキシトシンを抽出する代替法は以下の通りです。
1. 2倍量の氷冷アセトンをサンプルに添加し、ボルテックスする。
2. 12,000 x g で 20 分間遠心する。
3. 上清を新しいチューブに入れ替える。
4. 5倍量の氷冷石油エーテルを添加し、ボルテックスする。
5. 10,000 x g で 10 分間遠心する。
6. 上部のエーテル相を廃棄する。残りの水相を慎重にガラスチューブに取り出し、窒素ガスまたはアルゴンガス下で乾燥させる。
7. アッセイバッファーに再懸濁する。
抽出過程からのペプチド回収率は異なります。過程を最適化させ、至適回復率を得ることが重要です。抽出効率は、放射性ペプチドの利用またはペア標本を添加し、既知オキシトシン量の回収率を決定するなど、種々の手法で決定することができます。

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【3-49】 オキシトシン抽出にはどのようなカラムが使えますか。

200 mgの吸着剤を含み容積容量3.5mLの逆相C18カラムを用いた固相抽出 (SPE) が可能です。より低容量の血清/血漿を使用する場合は、小さいカートリッジも使用できます。

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【3-50】 オキシトシンとArg8-バソプレシンELISAキットで分析する場合のサンプルの乾燥方法を教えて下さい。

サンプルは、吸引遠心器 (SpeedVacなど) や窒素やアルゴンの緩やかな気流で乾燥させます。サンプル数が多い場合、吸引遠心器の方がよいかもしれません。サンプルを室温で一晩、SpeedVacに入れて放置します。翌日には乾燥しており、吸引中は環境下に晒されていないため、サンプルの完全性は損なわれていないはずです。緩やかな窒素の気流を使って乾燥させる場合、ガス供給部の下にガラスピペットを装着し、ピペットをサンプルチューブ内底部に吊るします。この方法を用いる場合、まずは石油エーテルを入れたチューブでまずは練習し、どのくらい時間がかかるか確認してください。サンプルをフード内に放置して乾燥させることはお奨めしません。サンプルが酸化し、わずかに残った溶剤がEIAに影響を及ぼす可能性があるためです。

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■ Progesterone ELISA kit » 商品詳細はこちら

【3-51】 プロゲステロンELISAキットはどの動物種由来サンプルにも使えますか。

プロゲステロンは全動物種で保存されており、本キットで使用する抗体は動物種に関わらずプロゲステロンに結合します。したがって、本製品は基本的に 「動物種非依存性」 です。ただし、もしマウス由来のサンプルで IgG を含む場合 (血清や血漿サンプルのように)、注意が必要です。ご提供するプレートはマウスIgG捕捉抗体でコートしていますので、サンプルに内在性マウスIgG が含まれる場合は干渉することが考えられます。

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【3-52】 プロトコールに自分が対象とするサンプルタイプが記載されていませんでした。どうしたら使えますか。

Enzo Life Sciences社ウェブサイトの 「Application」 およびキットのプロトコールに、本品を用いて良好に試験が行えたサンプルタイプをリスト化しています。サンプル内に十分量の分析物が存在し、マトリックス干渉を除去するために十分な希釈を行った後もその濃度が検量線範囲内であれば、リスト以外のサンプルタイプでもアッセイできるはずです。もしEnzo Life Sciences社で検証していないサンプルタイプをご使用になる場合は、既報論文に詳細が記載されていないかご確認ください。

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【3-53】 自分で使用するサンプルタイプの最適な希釈率を教えて下さい。

マニュアルの "Sample recoveries" セクションに推奨希釈率を記載しています。この値は、Enzo Life Sciences社にてマトリックス干渉を除くために必要だと決定した希釈率です。ただし、お客様ご自身で、対象サンプルにおける最適希釈率を決定されることをお奨めします。そのため、Enzo Life Sciences社の推奨希釈率は"出発点"としてご理解ください。

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【3-54】 最少サンプル量を教えてください。

アッセイにはウェルごとに100 µL の希釈サンプルが必要です。そのためサンプル希釈率やサンプル数によってご判断ください。サンプルは二回繰返し (duplicate) で試験します。

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【3-55】 キットマニュアルの "Sample Handling" で、"サンプルによっては分析物の存在レベルが非常に低く、正確に測定するためには抽出が必要となる場合があります"とあります。どの濃度範囲のことを示しているのでしょうか。

サンプル中の分析物濃度がアッセイの検出限界未満である場合にのみ抽出が必要です。マトリックス干渉を除去するために十分な希釈を行った後でもサンプルから分析物が検出できるのであれば、抽出は必要ありません。もし試験の結果、ステロイドが読み取り不可であった場合、抽出が必要です。

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【3-56】 Steroid displacement reagent (SDR) のメカニズムを教えて下さい。

血液中のほとんどのステロイドはアルブミンや、より特異的な結合タンパク質などの担体タンパク質にイオン結合しています。サンプルを Steroid Displacement Reagent で処理することで、ステロイドと担体タンパク質間の電荷相互作用を破壊します。これによりサンプル中に存在するステロイド全量を測定することができます。

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【3-57】 Progesterone ELISA kitを使用する場合、どのようにサンプルをSteroid displacement reagent (SDR) 処理すればよいですか。

以下に従い、Steroid Displacement Reagent でサンプルを処理してください。
・99 µLのサンプルごとに 1 µLの SDR を添加する。
・ボルテックスに短時間掛け、室温で5分静置する。
・その後、サンプル希釈を行う。
抽出サンプルの場合は、SDR処理の必要はありません。

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【3-58】 このELISAキットでは、なぜサンプル希釈が必要ですか。

希釈することにはいくつかの理由があります。サンプルが検量線を超える場合、本アッセイの検量線内で測定できるように希釈が必要となる場合があります。また、サンプルによってはマトリックス干渉を防ぐために希釈が必要な場合があります。

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【3-59】 サンプルマトリックス干渉はどうすれば防ぐことができますか。

サンプルマトリックス干渉を防ぐ最も簡単な方法は、アッセイバッファーでサンプルを希釈することです。最低必要希釈率を決定するには、1つのサンプルを2分割します。1つには既知量の標準物質を加えます。2分割とも、アッセイバッファーを用いて段階希釈系列をとります (1 : 2、1 : 4、1 : 8、1 : 16など)。その後、これらのサンプル全てを本品で分析し、各希釈サンプルに対して濃度と回収率を決定します。回収率が添加分析物の量に対して 80 % 〜 120 % になったときが最低必要希釈率です。 もし、サンプルを希釈後、分析物濃度が本アッセイでの分析範囲内に入るような場合は、その希釈率が一番最良です。もし、そうならなかった場合は、マニュアルに沿って抽出作業が必要になります。

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【3-60】 自分のサンプルにマトリックス干渉の可能性があるかを確認する方法を教えて下さい。

マトリックス干渉とは、サンプルマトリックス(バッファー、pH、界面活性剤や溶剤などの添加物、タンパク質など)がアッセイを妨害し、不正確な結果を導くことを示します。このような干渉は誤った抑制、または誤った分析物レベルの上昇として現れます。マトリックス干渉を試験する方法として、添加回収率の確認があります。代表とするサンプル (1つか2つ) を2分割します。1つには既知量の分析物 (標準物質) を添加します。このサンプルは"添加サンプル (spiked sample)"と呼びます。同時に、添加サンプルと添加していないサンプルをアッセイします。添加物の回収率は、内在性寄与物 (添加していないサンプルにおける測定濃度) を添加サンプルの全分析物濃度から減算し、添加サンプルに添加した標準物質濃度で割った後100倍します。許容できる回収率は添加サンプルの80%から120%です。

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【3-61】 希釈率で結果を掛け算すべきでしょうか。

はい。算出したデータに希釈率を掛け合わせ、サンプル中に存在する生物マーカー存在量の正しい値を算出します。

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【3-62】 他のステロイドとの交差反応は確認してありますか。

はい。関連するステロイド化合物に関する交差性を評価し、キットマニュアルに記載しています。

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【3-63】 ステロイドが対象のELISAキット用陽性コントロールは販売していますか。

陽性コントロールの提供はしていません。もし特定サンプルタイプから分析物を正確に回収できているかを確認する場合、既知量の標準物質をサンプルに添加し、キットを使ってアッセイを行い、回収率を評価して下さい。

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■ Serotonin ELISA kit » 商品詳細はこちら

【3-64】 Serotonin ELISAキット (品番ADI-900-175) はどの動物種に対しても使えますか。

セロトニンは全動物種で保存されており、本キットで使用する抗体は動物種に関わらずセロトニンに結合します。したがって、本製品は基本的に 「動物種非依存性」 です。ただし、もしウサギ由来のサンプルで IgG を含む場合は注意が必要です。ご提供するプレートはウサギIgG捕捉抗体でコートしていますので、サンプルに内在性ウサギIgG が含まれる場合は干渉することが考えられます。

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【3-65】 ADI-900-175にはどのような血漿サンプルを推奨されますか。

本キットはクエン酸血漿サンプルを用いて検証しています。EDTA血漿も最終EDTA濃度が10 mM を超えなければ使用できると思いますが、これを超える場合、コンジュゲートの活性に影響を及ぼす可能性があります。ヘパリン化血漿サンプルはお奨めしません。

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【3-66】 再懸濁した標準物質、抗体、およびコンジュゲートの保存方法を教えて下さい。

標準物質、抗体、およびコンジュゲートは1回の使いきりで、-20℃で保存して下さい。余りは破棄してください。キットに添付している2本目のバイアルは他のアッセイ時にご利用ください。

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【3-67】 Serotonin ELISAキット (品番ADI-900-175) の陽性コントロールは販売していますか。または何が適当でしょうか。

Enzo Life Sciences社では陽性コントロールのご提供はしていません。もし特定サンプルタイプにおいてセロトニンが正確に回収できていることを確認する場合、既知量の標準物質をサンプルに添加し、キットを使ってアッセイを行い、回復率を評価して下さい。

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■ Testosterone ELISA kit » 商品詳細はこちら

【3-68】 テストステロンELISAキットはどの動物種にも使えますか。

テストステロンは全動物種で保存されており、本キットで使用する抗体は動物種に関わらずテストステロンに結合します。したがって、本製品は基本的に 「動物種非依存性」 です。ただし、もしマウス由来のサンプルで IgG を含む場合 (血清や血漿サンプルのように)、注意が必要です。ご提供するプレートはマウスIgG捕捉抗体でコートしていますので、サンプルに内在性マウスIgGが含まれる場合は干渉することが考えられます。

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【3-69】 プロトコールに自分が対象とするサンプルタイプが記載されていませんでした。どうしたら使えますか。

Enzo Life Sciences社ウェブサイトの 「Application」 およびキットのプロトコールに、本品を用いて良好に試験が行えたサンプルタイプをリスト化しています。サンプル内に十分量の分析物が存在し、マトリックス干渉を除去するために十分な希釈を行った後もその濃度が検量線範囲内であれば、リスト以外のサンプルタイプでもアッセイできるはずです。もしEnzo Life Sciences社で検証していないサンプルタイプをご使用になる場合は、既報論文に詳細が記載されていないかご確認ください。

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【3-70】 ヒト血漿や血清サンプルを使えますか。

Enzo Life Sciences社のウェブサイトの 「Application」 およびキットのマニュアルに、本品を使って検証済みのサンプルタイプをリスト化しています。ヒト血清や血漿サンプルには、ADI-900-176 (Testosterone hight sensitivity ELISA kit) のご使用をお奨めします。

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【3-71】 自分で使用するサンプルタイプの最適な希釈率を教えて下さい。

マニュアルの"Sample recoveries"セクションに推奨希釈率を記載しています。この値は、 nzo Life Sciences社にてマトリックス干渉を除くために必要だと決定した希釈率です。ただし、お客様ご自身で、対象サンプルにおける最適希釈率を決定されることをお奨めします。そのため、Enzo Life Sciences社の推奨希釈率は"出発点"としてご理解ください。

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【3-72】 最少サンプル量を教えてください。

アッセイにはウェルごとに100 µL の希釈サンプルが必要です。そのためサンプル希釈率やサンプル数によってご判断ください。サンプルは二回繰返し (duplicate) で試験します。

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【3-73】 キットマニュアルの "Sample Handling" で、"サンプルによっては分析物の存在レベルが非常に低く、正確に測定するためには抽出が必要となる場合があります"とあります。どの濃度範囲のことを示しているのでしょうか。

サンプル中の分析物濃度がアッセイの検出限界未満である場合にのみ抽出が必要です。マトリックス干渉を除去するために十分な希釈を行った後でもサンプルから分析物が検出できるのであれば、抽出は必要ありません。もし試験の結果、ステロイドが読み取り不可であった場合、抽出が必要です。

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【3-74】 Steroid displacement reagent (SDR) のメカニズムを教えて下さい。

血液中のほとんどのステロイドはアルブミンや、より特異的な結合タンパク質などの担体タンパク質にイオン結合しています。サンプルを Steroid Displacement Reagent で処理することで、ステロイドと担体タンパク質間の電荷相互作用を破壊します。これによりサンプル中に存在するステロイド全量を測定することができます。

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【3-75】 Teststerone ELISA kitを使用する場合、どのようにサンプルをSteroid displacement reagent (SDR) 処理すればよいですか。

以下に従い、Steroid Displacement Reagent でサンプルを処理してください。
・99 µLのサンプルごとに 1 µLの SDR を添加する。
・ボルテックスに短時間掛け、室温で5分静置する。
・その後、サンプル希釈を行う。
抽出サンプルの場合は、SDR処理の必要はありません。

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【3-76】 このELISAキットでは、なぜサンプル希釈が必要ですか。

希釈することにはいくつかの理由があります。サンプルが検量線を超える場合、本アッセイの検量線内で測定できるように希釈が必要となる場合があります。また、サンプルによってはマトリックス干渉を防ぐために希釈が必要な場合があります。

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【3-77】 サンプルマトリックス干渉はどうすれば防ぐことができますか。

サンプルマトリックス干渉を防ぐ最も簡単な方法は、アッセイバッファーでサンプルを希釈することです。最低必要希釈率を決定するには、1つのサンプルを2分割します。1つには既知量の標準物質を加えます。2分割とも、アッセイバッファーを用いて段階希釈系列をとります (1 : 2、1 : 4、1 : 8、1 : 16など)。その後、これらのサンプル全てを本品で分析し、各希釈サンプルに対して濃度と回収率を決定します。回収率が添加分析物の量に対して 80 % 〜 120 % になったときが最低必要希釈率です。もし、サンプルを希釈後、分析物濃度が本アッセイでの分析範囲内に入るような場合は、その希釈率が一番最良です。もし、そうならなかった場合は、マニュアルに沿って抽出作業が必要になります。

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【3-78】 自分のサンプルにマトリックス干渉の可能性があるかを確認する方法を教えて下さい。

マトリックス干渉とは、サンプルマトリックス(バッファー、pH、界面活性剤や溶剤などの添加物、タンパク質など)がアッセイを妨害し、不正確な結果を導くことを示します。このような干渉は誤った抑制、または誤った分析物レベルの上昇として現れます。マトリックス干渉を試験する方法として、添加回収率の確認があります。代表とするサンプル (1つか2つ) を2分割します。1つには既知量の分析物 (標準物質) を添加します。このサンプルは"添加サンプル (spiked sample)"と呼びます。同時に、添加サンプルと添加していないサンプルをアッセイします。添加物の回収率は、内在性寄与物 (添加していないサンプルにおける測定濃度) を添加サンプルの全分析物濃度から減算し、添加サンプルに添加した標準物質濃度で割った後100倍します。許容できる回収率は添加サンプルの80%から120%です。

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【3-79】 希釈率で結果を掛け算すべきでしょうか。

はい。算出したデータに希釈率を掛け合わせ、サンプル中に存在する生物マーカー存在量の正しい値を算出します。

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【3-80】 他のステロイドとの交差反応は確認してありますか。

はい。関連するステロイド化合物に関する交差性を評価し、キットマニュアルに記載しています。

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【3-81】 ステロイドが対象のELISAキット用陽性コントロールは販売していますか。

陽性コントロールの提供はしていません。もし特定サンプルタイプから分析物を正確に回収できているかを確認する場合、既知量の標準物質をサンプルに添加し、キットを使ってアッセイを行い、回収率を評価して下さい。

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■ Arg8-Vasopressin ELISA kit » 商品詳細はこちら

【3-82】 Vasopressin ELISA kitは動物種非依存性でしょうか。

バソプレシン分子配列は哺乳動物種間で保存されており、本製品は基本的に 「動物種非依存性」 です。使用文献に掲載されている動物種として、ヒト、マウス、ラットがあります。ウサギ血清を用いる場合は問題となる場合があります。これはバソプレシン自身の問題ではなく、本キットで使用している抗体が抗ウサギIgGであるため、バックグラウンドシグナルが高くなる可能性があります。

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【3-83】 ウサギ血清を使用しています。このキットを使ってサンプル中のバソプレシンを検出できますか。

本キットでは抗ウサギIgG を使用するため、ウサギサンプルは問題になる可能性があります。アッセイを行う前に、内在性ウサギIgG をMWCOフィルターで除去するか、IgG removal kitで除去すれば、本品を使用できる可能性があります。ただし、Enzo Life Sciences社ではこの点を検討しておらず、お客様ご自身で最適化していただく必要があります。

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【3-84】 バソプレシンキットは培養上清以外のサンプルタイプに使えますか。

使用文献から血漿や尿も使えます。一般に、マトリックス干渉を防ぐためにサンプルを希釈しても、十分量の分析物が存在しその濃度が検量線の範囲内であるならば、アッセイは可能です。

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【3-85】 バソプレシンELISAキットは唾液サンプルにも使えますか。

Enzo Life Science社では唾液サンプルでの試験は行っていません。しかし、唾液サンプルを使用した研究者がプロトコールを共有してくれています。本プロトコールはお客様のサンプルタイプによってはさらに最適化が必要であることをご留意下さい。
1. 少なくとも1 mLの唾液を回収する。サンプルは使用するまで-20℃で保存する。
2. 遠心して粒子を沈殿させ、粘膜をチューブの底に落とす。
3. 上清を回収し、1 mL ずつ分注する。
4. 遠心蒸発器 (SppeVacなど) で1 mL を蒸発させて乾燥させる。
5. 乾燥サンプルを 250 µL アッセイバッファーで再懸濁する。
これらのサンプルは4倍濃縮されており、干渉因子を含まないようになっているはずです。

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【3-86】 バソプレシン抽出は必要ですか。

Enzo Life Sciences社のVasopressin ELISAキットには、どのサンプルタイプであっても正確な判定にバソプレシン抽出は必要ありません。

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【3-87】 血清や血漿サンプル中のバソプレシン抽出プロトコールの代替法はありますか。

以下が水溶性サンプルからのバソプレシン抽出の代替法です。固相抽出ステップがあります。
1. サンプルに等量の0.1 % トリフルオロ酢酸水溶液 (TFA-H2O) を添加する。17,000 x g で15分間、4℃で遠心する。上清を回収する。
2. 200 mg C18 Sep-Pak カラムを 1 mL のアセトニトリルで平衡化し、さらに10〜25 mL の 0.1 % TFA-H2O で平衡化する。
3. 上清を Sep-Pakカラムに通し、10〜25 mL の0.1% TFA-H2Oで洗浄する。洗浄した液は廃棄する。
4. 3 mL の溶出溶液 (アセトニトリルが 60 %、0.1% TFA-H2O が 40 %) をゆっくり注ぎ、サンプルを溶出し、プラスチックチューブに回収する。
5. 吸引遠心蒸発器で乾燥させる。低温での乾燥を推奨。-20 ℃ で保存。
6. アッセイバッファーに再懸濁し、すぐに測定する。サンプルによっては、再懸濁後、不溶性物質がみられることもあるのでサンプルをプレートに加える際、不溶性物質は入れないよう注意する。
抽出作業からのペプチド回収率は様々です。高い回収率を得られるよう作業の最適化が重要です。抽出効率が分かる方法は、放射性ペプチドの利用や添加回収試験などいくつかあります。

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【3-88】 オキシトシンとArg8-バソプレシンELISAキットで分析する場合のサンプルの乾燥方法を教えて下さい。

サンプルは、吸引遠心器 (SpeedVacなど) や窒素やアルゴンの緩やかな気流で乾燥させます。サンプル数が多い場合、吸引遠心器の方がよいかもしれません。サンプルを室温で一晩、SpeedVacに入れて放置します。翌日には乾燥しており、吸引中は環境下に晒されていないため、サンプルの完全性は損なわれていないはずです。 緩やかな窒素の気流を使って乾燥させる場合、ガス供給部の下にガラスピペットを装着し、ピペットをサンプルチューブ内底部に吊るします。この方法を用いる場合、まずは石油エーテルを入れたチューブでまずは練習し、どのくらい時間がかかるか確認してください。サンプルをフード内に放置して乾燥させることはお奨めしません。サンプルが酸化し、わずかに残った溶剤がEIAに影響を及ぼす可能性があるためです。

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4. エイコサノイド

■ Urinary prostacyclin ELISA kit » 商品詳細はこちら

【4-01】 プロスタサイクリンの測定に6-keto-PGF1α ELISAキットが使用できるのであれば、Urinary prostacyclin ELISAキットの目的は何ですか。

尿中では、プロスタサイクリンは6-keto-PGF1αに分解され、これがさらに分解されて2, 3-dinor-6-keto-PGF1α となります。したがって、尿中の真のプロスタサイクリン量を概算するには、6-keto-PGF1α と 2, 3-dinor-6-keto-PGF1α の両方を測定する必要があります。Urinary Prostacyclin ELISAキットでは、この両方を測定することができます。プロスタサイクリンの分解は別のマトリックスでは同じではありません。

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5. 代謝

■ NGAL ELISA kit » 商品詳細はこちら

【5-01】 通常のELISAと rapid ELISAキットの違いは何ですか。

通常の human NGAL ELISA kits (BPD-KIT-036) は感度が高く(10-1000 pg/mL)、サンプル希釈率を上げる必要があります。また、プロトコールの処理時間が長く (〜4 時間)、40 サンプルまで処理ができます。これに対し、rapid human NGAL ELISA kits (BPD-KIT-037) は感度が劣り (0.2-20 ng/mL)、希釈率は低くなります。ただし、プロトコールの処理時間が短く(<1時間)、41 サンプルまで処理が可能です。

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【5-02】 NGAL (human) ELISA kitはヒト以外にも使えますか。

本キットはヒトサンプルのみに対して開発され、検証されています。Enzo Life Sciences社では他に動物種に特化した NGAL ELISAキットを提供しています。これらはマウス、ラット、サル、ブタ、およびネコのサンプルに対して検証してあります。現在ご提供中のNGAL ELISA キットの種類に関しては、コスモ・バイオまでお問い合わせください。

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【5-03】 NGAL (human) ELISAキットに使う血漿サンプルはどのように調製すればよいですか。

市販の抗凝固剤処理チューブ (EDTA処理 (ラベンダートップ) やクエン酸処理 (薄青色トップ) など) に全血を回収します。ヘパリン処理したチューブ (緑色トップ) はいくつかのアプリケーションで使用が推奨されていますが、ヘパリンはしばしばエンドトキシン汚染されており、白血球を刺激してサイトカインが放出されることがあります。冷却遠心器で 1000-2000 x g、10分間遠心し、血漿から細胞を除去します (遠心ブレーキは使用しないこと)。2000 x gで15分間遠心することで血漿サンプルから血小板を分離できます。得られた上清が血漿です。遠心後、直ちに液相 (血漿) を新しいポリプロピレンチューブにパスツールピペットで移しとります。サンプルは操作中2-8℃に置いてください。もしすぐに血漿を使用しない場合は、0.5 mLずつに分注し、-20 ℃以下で保存します。凍結解凍サイクルを繰返さないことが重要です。溶血、黄疸性、脂肪血症のサンプルはいくつかのテストには使えません。

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【5-04】 NGAL (human) ELISAキットに使う血清サンプルはどのように調製すればよいですか。

市販の採血チューブに全血を回収します。チューブはBecton Dickinson (BD) 社で「Vacutainer」 という商品名で販売されています。全血回収後、室温で4時間、もしくは4℃で24時間静置します。冷却遠心器で 1000-2000 x g、10分間遠心し、クロットを除去します (遠心ブレーキは使用しないこと)。得られた上清が血清です。遠心後、直ちに液相 (血清) を新しいポリプロピレンチューブにパスツールピペットで移しとります。サンプルは操作中2-8℃に置いてください。もしすぐに血清を使用しない場合は、0.5 mLずつに分注し、-20 ℃以下で保存します。凍結解凍サイクルを繰返さないことが重要です。溶血、黄疸性、脂肪血症のサンプルはいくつかのテストには使えません。

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【5-05】 NGAL (human) ELISA kitに使用する尿サンプルの調製方法を教えて下さい。

もし尿路に炎症や感染がある場合は、多形核好中球や他の細胞デブリを除去するために遠心が必要になります。しかし正常な尿サンプルも血清サンプルと同様に、遠心し、取り扱うことをお奨めします。

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【5-06】 NGAL (human) ELISA kitを使う場合、サンプルタイプによってアッセイ結果は変わりますか。

血清、EDTA血漿、クエン酸血漿、ヘパリン血漿、または尿のサンプルを使って分析する場合、添加回収回復、直線性、精度に顕著な相違は見られませんでした。ただし、NGAL濃度は、しばしば血漿に比べて血清中で高く、おそらく血液凝固における好中球の放出によるものたど思われます。

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【5-07】 NGAL (human) ELISA kit用に調製したサンプルの保存方法を教えて下さい。

すぐにアッセイを行う場合は、サンプルを分注後、2〜8℃で保存してください。または、-20 ℃ で 2ヶ月以内、長期保存する場合は、-80 ℃以下で保存してください。

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6. 酸化ストレス

■ HO-1, ELISA kit » 商品詳細はこちら

【6-01】 ADI-EKS-800, HO-1 (human) ELISA kitはヒト血漿と血清にも使えますか。

本キットは細胞ライセートと組織抽出物の細胞内HO-1の測定を検証しています。プロトコールではこれらのサンプルタイプのみについて提言しています。HO-1の循環レベルは通常低いと考えられていますが、本キットを利用してヒト血清や血漿の HO-1検出を行われた研究者もいらっしゃいます。Enzo Life Sciences社ウェブサイトの商品ページ下部にある 「Product Literature References」 より使用文献をご確認ください。血漿や血清に本キットをご利用になる場合、添加回収試験を行い、サンプルのパラメータを最適化することを強くお奨めします。この実験を行う場合、1〜2種類の代表的なサンプルを、2群に分け、一方には既知濃度のHO-1スタンダード (キット添付) を添加し、もう一方には添加せず、両方に対して段階希釈系列をとります。これにより内在性と添加したものを比較して最適化することができます。添加回収試験では、どの希釈率で最適な直線性が得られるかわかるだけでなく、各希釈率における回収率が算出でき、どの希釈率で最も精度の高いデータが得られるかを確認できます。サンプル中に十分なHO-1が存在し、マトリックス干渉が除去可能な十分な希釈を行った後もデータの読み取りが可能な場合は、信頼して本キットを使用できます。

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【6-02】 細胞ライセートをすぐに使わない場合、どのように取扱い、保存すればよいですか。

HO-1分解を防ぐために、マニュアルに記載しているように、溶解バッファーにプロテアーゼインヒビターを添加してください。もしすぐに解析できない場合は、-80℃で保存して下さい。凍結融解を防ぐため、サンプルを分注しておくことを強くお奨めします。

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【6-03】 TMB基質溶液は透明だと思っていましたが、緑青色がかっていました。なぜ色が変わったのでしょうか。

TMB基質に色がついたのはコンジュゲートによる汚染です。汚染を防ぐには、使い捨てピペットチップを各試薬の添加ごとに交換し、試薬を小分けしておくことが大切です。使い残りの溶液は、元の容器に決して戻さないで下さい。残りの試薬も汚染してしまう可能性があります。

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【6-04】 HO-1 (h) ELISAはHO-2やHO-3と交差反応しますか。

本アッセイはヒトHO-1に特異的であり、他のアイソトープであるヒトHO-2やHO-3とは交差性を示しません。

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【6-05】 ADI-EKS-800, HO-1 (human) ELISA kitの組換え型HO-1スタンダードの詳細を教えて下さい。

本スタンダードはE.coliで発現させた組換え型ヒトHO-1 (UniProt ID: P09601) です。

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7. プロテオスタシス/シャペロン

■ HPS70 ELISA キット » 商品詳細はこちら

【7-01】 恒常的細胞質型HSP70をADI-EKS-700BまたはADI-EKS-715で検出できますか。

これらのアッセイは誘導型HSP70に特異的であり、恒常的細胞質型HSP70は検出しませんので実験計画を立てる際にご留意ください。アッセイで使用するサンプルの最適希釈と同じように、サンプル回収までのストレス処理持続時間と回復時間を最適化する必要があります。

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【7-02】 ADI-EKS-700B, ADI-EKS-715, ADI-EKS-725A, ADI-EKS-750を使用する場合、使用するサンプル量と推奨希釈率を教えて下さい。

必要サンプル量と希釈率はサンプル中のHSP70、HSP70B量、またはHSP70に対するIgG量によって異なります。同じサンプルタイプ、条件、アッセイ技術等で同一マーカーを使用している研究報告などを参考にすることをお勧めします。

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8. BIOLIKE™ コンフォメーショナル ELISAキット

■ BIOLIKE™ コンフォメーショナル ELISAキット » 商品詳細はこちら

【8-01】 Bevacizumabの商品名とその機能を教えて下さい。

Bevacizumab の商品名は AvastinR (Genentech/Roche) です。ヒト化モノクローナル抗体であり、血管内皮増殖因子A (VEGF-A) を阻害します。本品は米国で初めて臨床利用が可能となった血管新生阻害剤であり、特定の転移性がんへの使用にFDAが認可しています。

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【8-02】 Alemtuzumab の商品名とその機能を教えて下さい。

アレムツズマブの商品名は、CampathR (Sanofi) です。ヒト化モノクローナル抗体であり、CD52とよばれるリンパ球の細胞表面受容体を標的します。慢性リンパ性白血病やある種のリンパ腫の治療に用いられます。

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【8-03】 Trastuzumab の商品名とその機能を教えて下さい。

トラスツズマブの商品名は、HerceptinR (Genentech/Roshe) です。ヒト化モノクローナル抗体であり、HER2/neu受容体を標的します。特定の乳がん治療に使用され、他のHER2/neuを過剰発現する癌にも確認試験が行われています。

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【8-04】 Adalimumab の商品名と機能を教えて下さい。

アダリムマブの商品名は、HumiraR (AbbVie Inc) です。ヒトモノクローナル抗体でTNFαを標的しTNF受容体の活性化を妨害します。TNFαの不活性化は、自己免疫疾患関連の炎症治療に有効であることが示されています。

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【8-05】 Palivizumabの商品名とその機能を教えて下さい。

パリビズマブの商品名は、SynagisR (MedImmune) です。ヒト化モノクローナル抗体で、呼吸器多核体ウイルス(RSV)の抗原部位に配向性があります。細胞への侵入を阻害するため、感染を防御します。

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【8-06】 Cetuximab の商品名とその機能を教えて下さい。

セツキシマブの商品名は、ErbituxR (Bristol-Myers Squibb/Eli Lilly と Company/Merck KGaA) です。キメラ (マウス/ヒト) モノクローナル抗体であり、上皮成長因子受容体 (EGFR) を阻害します。転移性大腸がんと頭頸部がんの治療に使用されています。

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【8-07】 Infliximabの商品名とその機能を教えて下さい。

インフリキシマブの商品名は、RemicadeR (Janssen Biotech Inc) です。TNF-αに対するキメラモノクローナル抗体です。クローン病治療用としてFDAにより1998年に初めて認可されました。その後、続けて乾癬、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および潰瘍性大腸炎の治療用としても認可されています。

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【8-08】 Rituximabの商品名とその機能を教えて下さい。

リツキシマブの商品名は、Rituxan R(Genentech/Roche) です。CD20とよばれるB細胞上の細胞表面受容体に対するキメラモノクローナル抗体です。B細胞過多により特徴付けられるリンパ腫、白血病、および自己免疫疾患の治療に使用されています。

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【8-09】 本キットはどのような新規モノクローナル抗体にも使えますか、またはバイオシミラーの比較のみに使用可能でしょうか。

新規モノクローナル抗体に対しては、BIOLIKER Conserved mAb sequence confromational ELISA kit (ENZ-KIT123) をご利用ください。全てのヒトモノクローナル抗体にはほとんど同一の定常領域配列が存在するため、この定量領域を含む抗体 (22 種類の抗体) はどのようなヒトモノクローナル抗体でもカバーするはずです。このアプローチの科学的根拠は、可変領域であっても約66 %の配列が保存されているからです。3 種類の CDR領域にも配列類似性が存在します。8 種類の抗体を用いて可変領域の各12領域を網羅することでどのような新規モノクローナル抗体に対しても良好なカバー率が得られると思います。さらに、EnzoLife Sciences社の特定的な BIOLIKER ELISA kitで網羅できないバイオシミラーモノクローナル抗体の場合、BIOLIKER Conserved mAb sequence confromational ELISA kit (ENZ-KIT123) は良好な感度で使用できます。

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【8-10】 BIOLIKE conformational ELISA kitはどのようなデザインになっていますか。

BIOLIKE conformational ELISA kitsは一般的な免疫技術であるエピトープ走査法を基にしています。抗体への相互作用をペプチドで探るためにオーバーラップしたペプチドを合成し、抗体に認識されるエピトープの同定を行います。ペプチドを選択する工程では、基本的なペプチドデザイン原則と共に可能性のある2次構造 (安定した2次構造を形成するペプチド長、ペプチド合成能力、など) も考慮しています。モノクローナル抗体分子全体をカバーするため、Enzo Life Sciences社では4〜5残基がオーバーラップする約30アミノ酸長のペプチドをデザインするので、34種類の抗体を用意しました。

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【8-11】 BIOLIKE® ELISA kitの抗体は精製されていますか。その場合、精製方法を教えて下さい。

34種類のオーバーラップした領域を網羅するモノクローナル抗体をウサギを用いて産生しました。ポリクローナル抗体を用いることで各領域において複数のエピトープを対象とすることができ、エピトープ検出感度を最大限にできます。抗体はGE Healthcare社の MabSelect™ (Protein A affinity column) を使用して精製しています。特異性は各領域に対して確認しています。

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【8-12】 抗体産生にペプチドを使用するのはなぜですか。

抗体産生にペプチドを利用するのは、モノクローナル抗体分子の全体を系統的にカバーすることを保証するためです。抗体応答として現在分かっていることは、抗体産生のための1つのエプトープに 5〜6個の直鎖アミノ酸 (時に3〜4個) が必要であるということです。 Enzo Life Sciences社で使用しているペプチドは 30アミノ酸です。各ペプチドにより複数の直鎖状エピトープに対する多重の抗体が構築できる可能性があります。

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【8-13】 コンフォメーショナルELISAデータをどのように解釈すればよいのですか。

BIOLIKE Bevacizumab conformational ELISA kit (品番ENZ-KIT123) のようなコンフォメーショナルELISAでは、対比較 (提供するマイクロプレートの上部3列には、コントロールリファレンスモノクローナル抗体、下部3列には生物学的に類似した分子) では、2種類のモノクローナル抗体間のΔODが15%未満のものは立体的相違がないとみなされます。 もしΔODが15〜50%であれば、若干の立体的相違があると見なされます。これは、8 M 尿素処理モノクローナル抗体を使った結果に基づいています。この検討では、モノクローナル抗体を 8 M 尿素でアンフォールドしています。直鎖状エピトープはプレート上の捕捉抗体に自由にアクセスできるのでエピトープ露出によるリファレンスシグナルが得られます。スパイク試験の結果、ΔODが 50 % 未満の場合、コントロールに比べて新規エピトープ露出は0.1 % 未満を示します。製品に関連した不純物 (立体構造不純物ともよばれる) だけが検出されているため、この違いはマイナーなものとみなされます。 もし、ΔODが50%以上の場合、主要な立体構造相違があるとみなされます。場合によっては、生物学的類似分子であってもΔODが100 %に近く主要な立体構造偏差があることもあります。

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9. その他ELISAキット

E. coli Host Cell Protein ELISA Kit » 商品詳細はこちら

【9-01】 E.coli 宿主細胞タンパク質標準物質はどのようにして産生されたものですか。

企業で使用されていて、生物製剤生存に使用されているほとんどのE.coli株はK12株由来です。E.coli 宿主細胞タンパク質ELISAは 2種の E.coli K12株から抽出した水溶性タンパク質を使って開発しています。Enzo Life Sicences社で作製した 2種の抗体を用いた交差性カバー試験では、80 %以上のカバー率でした。言い換えると、株1の抗体で株2の宿主細胞タンパク質の80 %が検出でき、その逆も同様でした。E.coli 宿主細胞タンパク質の免疫原性が高いことから、E.coli HCP ELISAがほとんどの E.coli 株を網羅できると見込んでいます。

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【9-02】 E.coliやCHO宿主細胞タンパク質に対するポリクローナル抗体は精製されていますか。またその精製方法を教えて下さい。

これらの抗体は GE Healthcare社のMabSelect™(Protein A affinity column) を用いて精製してあります。

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【9-03】 E.coli 宿主細胞由来タンパク質(HCP)ELISA キット (品番ENZ-KIT-127-0001) とCHO宿主細胞由来タンパク質(HCP)ELISA キット (品番ENZ-KIT-128-0001) に含まれる抗体は、なぜHCPアフィニティカラムではなくプロテインAアフィニティカラムを使用しているのですか。

一番の理由は、商品の一貫性のためです。プロテインAアフィニティカラムの歴史は古く、非常によく開発されたカラムで、信頼性も十分あり、多くの巨大バイオ技術企業や製薬会社に抗体精製用として使用されています。またロットが変わっても抗体の品質は同じままです。一方で、HCPアフィニティカラムは何度かカスタム構築され、あまり強靭なものではありません。時間が経つと、HCPアフィニティカラムは変質し、抗体の品質が悪くなります。HCPアフィニティカラムよりプロテインAアフィニティカラムを選ぶことは、感度を犠牲にすることになります。しかし、FDAでは HCPレベル1〜100 ppm の生物製剤であれば容認できるとしています。キットの感度限度は 2.5 ppm (検量線の10 ng/mL データポイントをもとに、4 mg/mL の薬物基質を添加した場合) です。この値はHCP分析に対する規制上の要求事項を満たしています。

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■ CHO host cell protein ELISA kit » 商品詳細はこちら

【9-04】 CHO宿主細胞タンパク質スタンダードはどのように産生されたものですか。

CHO宿主細胞タンパク質スタンダードは複数の CHO K1細胞株を既知組成培地で浮遊培養し、調製しています。細胞培養条件は、実際の CHO産生条件を模倣しています。馴化培地から宿主細胞タンパク質を回収し、濃縮後、スタンダードとして使用し、また抗CHO宿主細胞タンパク質抗体産生における免疫原として使用しています。

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【9-05】 E.coliやCHO宿主細胞タンパク質に対するポリクローナル抗体は精製されていますか。またその精製方法を教えて下さい。

これらの抗体は GE Healthcare社のMabSelect™(Protein A affinity column) を用いて精製してあります。

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【9-06】 E.coli 宿主細胞由来タンパク質(HCP)ELISA キット (品番ENZ-KIT-127-0001) とCHO宿主細胞由来タンパク質(HCP)ELISA キット (品番ENZ-KIT-128-0001) に含まれる抗体は、なぜHCPアフィニティカラムではなくプロテインAアフィニティカラムを使用しているのですか。

一番の理由は、商品の一貫性のためです。プロテインAアフィニティカラムの歴史は古く、非常によく開発されたカラムで、信頼性も十分あり、多くの巨大バイオ技術企業や製薬会社に抗体精製用として使用されています。またロットが変わっても抗体の品質は同じままです。一方で、HCPアフィニティカラムは何度かカスタム構築され、あまり強靭なものではありません。時間が経つと、HCPアフィニティカラムは変質し、抗体の品質が悪くなります。HCPアフィニティカラムよりプロテインAアフィニティカラムを選ぶことは、感度を犠牲にすることになります。しかし、FDAでは HCPレベル1〜100 ppm の生物製剤であれば容認できるとしています。キットの感度限度は 2.5 ppm (検量線の10 ng/mL データポイントをもとに、4 mg/mL の薬物基質を添加した場合) です。この値はHCP分析に対する規制上の要求事項を満たしています。

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