サポート情報

Q&A

記事ID : 11692

FAQ : 101 Bio(OBL)社 エクソソーム単離用PureExo®キットについて

キットの選び方について

キットの使用方法について

キットの選び方について

【01】 本キットで、培養上清から大きいエクソソーム様の小胞(最大直径1000nm)を単離/精製することはできますか?

できません。本キットでは、直径が300nm以上の小胞は単離できません。

【02】 品番P101のキットを血漿に使用することはできますか?

血漿と血清の両方にご使用いただけます。

【03】 品番P101のキットで処理できる血清サンプルの必要最低量は?

必要最低量は 50μLです。100 μL 〜 400 μL の血清/血漿をご使用いただくことを推奨します。

【04】 本キットで、培養細胞から、エクソソームや内皮微粒子を単離できますか?

品番P100のキットは、細胞培養上清からエクソソームを単離するために使用するキットです。細胞から微粒子を単離することはできません。

【05】 本キットで精製したエクソソームには、IgG やビーズが混入していますか?

本キットは、単離に抗体やビーズを使用しないため、最終的に単離されたエクソソームに人工的に作製した IgG やビーズが混入することはありません。

【06】 本キットで精製したエクソソームには、アルブミンが含まれていますか?

細胞や血清サンプルの種類によっては、アルブミンが含まれる場合があります。例えば、肝細胞ではアルブミンが産生され、肝臓由来のエクソソーム(アルブミンを含む)が循環系に放出される可能性があります。

【07】 品番P100のキットを、アメーバ状のキイロタマホコリカビ(D.discoideum amoeba)に使用することはできますか?

本キットは、細胞から放出されたエクソソームや微小胞を捕捉します。アメーバのエクソソームを単離するには、細胞の場合と同様にアメーバの培養上清を回収し、本キットで精製することをお奨めします。

【08】 最終的なエクソソームの調製液に含まれるバッファーはどのような組成ですか?精製したエクソソームを用いたアッセイに影響はありますか?

最終的に単離したエクソソームは、PBSに懸濁された凝集ナノ粒子で、元々の培養上清または血清がごく微量含まれています。RNA/タンパク質の抽出、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いたアッセイ、表面標識などの各種アッセイに、バッファーの影響を考慮せずにご使用いただくことができます。

【09】 単離したエクソソームが高純度で、膜由来の微粒子(破砕された小胞)を含まないことをどうすれば確認できますか?

透過型電子顕微鏡(TEM)を用いたアッセイにより確認できます。本キットで細胞培養上清や血清から単離した微小胞は、電子顕微鏡による観察で、粒子を包む直径20-200nmの球状の膜であることがわかっています。これらの特徴から、回収した微小胞がエクソソームであると決定づけることができます。破砕された小胞は、直径が最大1000nmで、形が不規則であることが報告されています。また、動的光散乱によるサイズ分布パターン解析でも、単離した微小胞の直径が100から200nmの間にあることが示されています。

【10】 単離されたエクソソームは機能的な活性をもっていますか?

本キットで単離したエクソソームに含まれる、特異的な microRNA(miRNA)の機能を検討しました。miRNAの標的mRNA 3'UTR領域を組み込んだレポーターベクターをトランスフェクションした細胞にエクソソームを添加し、その後ルシフェラーゼ活性アッセイにより、エクソソーム由来のmiRNAが機能的に活性であることを確認しています。

キットの使用方法について

【11】 ガラスチューブを使う必要がありますか? ガラスチューブはどこのメーカーで扱っていますか?

ステップ3とステップ4では、プラスチックチューブの代わりにガラスチューブを使用する必要があります。

(推奨ガラスチューブ:Fisherbrand* Disposable Borosilicate Glass Tubes 品番14-961-26)
https://www.fishersci.com外部リンク

【12】 中間層に明確な"fluff"が見えません。

次のような可能性が考えられます。

  1. 細胞培養上清や血清を加える前に、溶液A/B/Cが完全に混合されていなかった。
  2. 細胞や細胞破片を取り除くための低速遠心分離をしなかった。
  3. 混合比が間違っている。例えば、A液 0.125 mL + B液 0.125 mL + C液 0.5 mL、培養上清 2 mLのように、混合溶液(A/B/C)に対するサンプル(血清/培養上清)の割合が高すぎると、中間層が目立たなくなります。
  4. 培養上清の量は最大 4 mL、細胞数は 5×10^5 個以下にする必要があります。細胞数や培養上清の量がこれより多い場合は、サンプルを複数に分ける必要があります。
  5. FBS由来のエクソソームを除去する目的で、細胞を48時間以上飢餓状態に置くことは避けてください。

【13】 単離したエクソソームの同定には、どのようなバイオマーカーを使用しますか?

Flotillin、CD9、CD63、CD81、Alix、TSG101 などのエクソソームマーカーを使用します。

【14】 精製したエクソソームを用いて qRT-PCR アッセイを行う際に、どんなキットを使用すればいいですか?

QIAGEN社 miScript II RT Kit(品番218160)、miScript SYBRR Green PCR Kit(品番218073)を推奨します。

【15】 エクソソーム由来RNAのRT-PCRアッセイにお奨めの内在性コントロールはありますか?

サンプルによって異なります。使用したエクソソームサンプルのコントロールとして適したリファレンス遺伝子を選択してください。下記にリファレンス遺伝子を示しますが、実験ごとに適切なコントロールを検証する必要があります。

cel-miR-39-3p
SNORD61
SNORD68
SNORD72

【16】 エクソソームの収量はどのくらいですか?

  • 品番P100(PureExo? キット - 細胞培養上清用)
    2 mL の細胞培養上清から、通常 50〜100 uL のエクソソームを単離できます(1回の反応で最大 4 mL の培養上清を処理できます)。
    回収したエクソソームを全て使用して、エクソソーム由来のタンパク質を抽出すると(品番P200 キットを使用)、得られるタンパク質の量は 2mL の培養上清から150〜200 μg、4 mL の培養上清から300〜400 μg です。
    単離したエクソソームを全て使用してRNAを抽出すると(品番P200 キットを使用)、得られるエクソソーム由来RNAの量は 2mL の培養上清から 50〜100 ng、4mL の培養上清から 100〜200 ng です。
  • 品番P101(PureExo? キット - 血清/血漿用)
    100 μL〜400 μL の血清から、通常 100〜200 μL のエクソソーム(PBSに懸濁)を単離できます。
    回収したエクソソームを全て使用して、エクソソーム由来のタンパク質を抽出すると(品番P200 キットを使用)、得られるタンパク質の量は 300〜400 μg です。
    単離したエクソソームを全て使用してRNAを抽出すると(品番P200 キットを使用)、得られるエクソソーム由来RNAの量は 200〜300 ng です。
  • 品番P120(DiagExo? キット、尿用)
    3 mL の尿から、通常 50〜200 μL のエクソソームを単離できます。
    回収したエクソソームを全て使用して、エクソソーム由来のタンパク質を抽出すると(品番P200 キットを使用)、得られるタンパク質の量は 150〜400 μg です。
    単離したエクソソームを全て使用してRNAを抽出すると(品番P200 キットを使用)、得られるエクソソーム由来RNAの量は 50〜200 ng です。
品番品名サンプル推奨サンプル量予想される収量
エクソソーム(in PBS)エクソソーム由来のタンパク質エクソソーム由来のRNA
P100 PureExo? エクソソーム単離キット
細胞培養上清用
細胞培養上清 2〜4 mL 50〜200 μL 150〜400 μg 50〜200 ng
P101 PureExo? エクソソーム単離キット
血清/血漿用
血清 200 μL 100〜200 μL 300〜400 μg 200〜300 ng
P120 DiagExo? エクソソーム単離キット
尿用
尿 3 mL 50〜200 μL 150〜400 μg 50〜200 ng
P121 DiagExo? エクソソーム単離キット
ヒト体液用
生体液 0.1〜1 mL サンプルにより異なる サンプルにより異なる サンプルにより異なる
P200 エクソソームRNA/タンパク質抽出キット エクソソーム 50〜100 μL - 150〜200 μg 50〜100 ng
P300 エクソソームタンパク質抽出キット
血清用
血清 200 μL 100〜200 μL 300〜400 μg -
※エクソソーム由来のタンパク質/RNAの収量は、品番P200のキットを用いて試験しています。他のキットを使用する場合は、収量が低下する場合があります。
※各反応ごとの収量は、サンプルによって異なります。

【17】 品番P101 のキットで血漿からエクソソームを単離する際に、ヘパリン/EDTAチューブを用いて血液サンプルを採取することはできますか?

できません。ヘパリンは、エクソソーム精製後のRNAアッセイに有意に影響します。EDTAは、エクソソーム精製後のPCRアッセイに影響を与える場合があります。血液サンプルの採取には、ヘパリン/EDTAの含まれていないチューブを使用してください。血液サンプルを速やかに遠心し、エクソソームを単離するための血漿を回収します。抗凝固剤を使用する必要がある場合は、EDTAチューブを使用して血液を採取してください。必要に応じて、エクソソーム精製後のPCR反応の Mg2+ 濃度を調整します。


メーカー・代理店一覧

サポート情報

SNSアカウント

© COSMO BIO